DNA-methyleringstesten in combinatie met smartphones voor vroege screening van tumoren en leukemiescreening met een nauwkeurigheid van 90,0%!

Vroege detectie van kanker op basis van vloeibare biopsie is een nieuwe richting in kankerdetectie en -diagnostiek die de afgelopen jaren door het Amerikaanse National Cancer Institute is voorgesteld, met als doel kanker of zelfs precancereuze laesies in een vroeg stadium op te sporen. Het is op grote schaal gebruikt als een nieuwe biomarker voor de vroege diagnose van diverse maligniteiten, waaronder longkanker, gastro-intestinale tumoren, gliomen en gynaecologische tumoren.

De opkomst van platforms voor de identificatie van methyleringslandschapsbiomarkers (Methylscape) kan de bestaande vroege screening voor kanker aanzienlijk verbeteren, waardoor patiënten zich in het vroegst behandelbare stadium bevinden.

Onlangs hebben onderzoekers een eenvoudig en direct sensorplatform ontwikkeld voor de detectie van methyleringslandschappen, gebaseerd op met cysteamine gecoate goudnanodeeltjes (Cyst/AuNP's), gecombineerd met een smartphone-gebaseerde biosensor die snelle, vroege screening van een breed scala aan tumoren mogelijk maakt. Vroege screening op leukemie kan binnen 15 minuten na DNA-extractie uit een bloedmonster worden uitgevoerd, met een nauwkeurigheid van 90,0%. De titel van het artikel is: Snelle detectie van kanker-DNA in menselijk bloed met behulp van met cysteamine gecoate AuNP's en een smartphone met machine learning.

Figuur 1. Een eenvoudig en snel detectieplatform voor kankerscreening via Cyst/AuNPs-componenten kan in twee eenvoudige stappen worden gerealiseerd.

Dit wordt weergegeven in Figuur 1. Eerst werden de DNA-fragmenten opgelost in een waterige oplossing. Vervolgens werden cysten/AuNP's aan de gemengde oplossing toegevoegd. Normaal en kwaadaardig DNA hebben verschillende methyleringseigenschappen, wat resulteert in DNA-fragmenten met verschillende zelfassemblagepatronen. Normaal DNA aggregeert losjes en aggregeert uiteindelijk cysten/AuNP's. Dit resulteert in de roodverschoven aard van cysten/AuNP's, waardoor een kleurverandering van rood naar paars met het blote oog kan worden waargenomen. Het unieke methyleringsprofiel van kanker-DNA daarentegen leidt tot de productie van grotere clusters van DNA-fragmenten.

Beelden van 96-wells platen werden gemaakt met een smartphonecamera. Kanker-DNA werd gemeten met een smartphone met machine learning, vergeleken met spectroscopiemethoden.

Kankerscreening in echte bloedmonsters

Om de bruikbaarheid van het sensorplatform uit te breiden, gebruikten de onderzoekers een sensor die in echte bloedmonsters met succes onderscheid kon maken tussen normaal en kankerachtig DNA. Methyleringspatronen op CpG-plaatsen reguleren epigenetisch de genexpressie. Bij bijna alle kankertypen is waargenomen dat veranderingen in DNA-methylering en daarmee in de expressie van genen die tumorvorming bevorderen, elkaar afwisselen.

Als model voor andere kankers die verband houden met DNA-methylering, gebruikten de onderzoekers bloedmonsters van leukemiepatiënten en gezonde controlepersonen om de effectiviteit van het methyleringslandschap bij het differentiëren van leukemiekankers te onderzoeken. Deze biomarker voor het methyleringslandschap presteert niet alleen beter dan bestaande snelle screeningsmethoden voor leukemie, maar toont ook aan dat deze eenvoudige en overzichtelijke test kan worden uitgebreid naar vroege detectie van een breed scala aan kankers.

DNA uit bloedmonsters van 31 leukemiepatiënten en 12 gezonde personen werd geanalyseerd. Zoals weergegeven in de boxplot in Figuur 2a, was de relatieve absorptie van de kankermonsters (ΔA650/525) lager dan die van DNA uit normale monsters. Dit kwam voornamelijk door de verhoogde hydrofobiciteit, wat leidde tot een dichte aggregatie van kanker-DNA, waardoor de aggregatie van cysten/AuNP's werd voorkomen. Hierdoor werden deze nanodeeltjes volledig verspreid in de buitenste lagen van de kankeraggregaten, wat resulteerde in een verschillende spreiding van cysten/AuNP's die werden geadsorbeerd aan normale en kanker-DNA-aggregaten. ROC-curven werden vervolgens gegenereerd door de drempelwaarde te variëren van een minimumwaarde van ΔA650/525 tot een maximumwaarde.

Figuur 2.(a) Relatieve absorptiewaarden van cyste-/AuNP-oplossingen die de aanwezigheid van normaal (blauw) en kanker-DNA (rood) onder geoptimaliseerde omstandigheden aantonen

(DA650/525) van boxplots; (b) ROC-analyse en evaluatie van diagnostische tests. (c) Verwarringsmatrix voor de diagnose van normale en kankerpatiënten. (d) Gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde (PPV), negatief voorspellende waarde (NPV) en nauwkeurigheid van de ontwikkelde methode.

Zoals weergegeven in figuur 2b, vertoonde de oppervlakte onder de ROC-curve (AUC = 0,9274) van de ontwikkelde sensor een hoge gevoeligheid en specificiteit. Zoals te zien is in de boxplot, is het laagste punt dat de normale DNA-groep vertegenwoordigt niet goed gescheiden van het hoogste punt dat de kanker-DNA-groep vertegenwoordigt; daarom werd logistieke regressie gebruikt om onderscheid te maken tussen de normale en de kankergroep. Gegeven een set onafhankelijke variabelen, schat deze de waarschijnlijkheid van het optreden van een gebeurtenis, zoals een kanker- of een normale groep. De afhankelijke variabele ligt tussen 0 en 1. Het resultaat is dus een waarschijnlijkheid. We hebben de waarschijnlijkheid van kankeridentificatie (P) bepaald op basis van ΔA650/525 als volgt.

waarbij b = 5,3533, w1 = -6,965. Voor monsterclassificatie duidt een waarschijnlijkheid kleiner dan 0,5 op een normaal monster, terwijl een waarschijnlijkheid van 0,5 of hoger duidt op een kankermonster. Figuur 2c toont de verwarringsmatrix die is gegenereerd door de 'leave-it-alone'-kruisvalidatie, die werd gebruikt om de stabiliteit van de classificatiemethode te valideren. Figuur 2d vat de diagnostische testevaluatie van de methode samen, inclusief gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde (PPV) en negatief voorspellende waarde (NPV).

Smartphone-gebaseerde biosensoren

Om het testen van monsters verder te vereenvoudigen zonder het gebruik van spectrofotometers, gebruikten de onderzoekers kunstmatige intelligentie (AI) om de kleur van de oplossing te interpreteren en onderscheid te maken tussen normale en kankerachtige individuen. Computer vision werd gebruikt om de kleur van de Cyst/AuNPs-oplossing te vertalen naar normaal DNA (paars) of kankerachtig DNA (rood) met behulp van beelden van 96-wells platen, gemaakt met de camera van een mobiele telefoon. Kunstmatige intelligentie kan de kosten verlagen en de toegankelijkheid verbeteren bij het interpreteren van de kleur van oplossingen van nanodeeltjes, en dat zonder het gebruik van optische hardware en smartphone-accessoires. Tot slot werden twee machine learning-modellen, waaronder Random Forest (RF) en Support Vector Machine (SVM), getraind om de modellen te construeren. Zowel het RF- als het SVM-model classificeerden de monsters correct als positief en negatief met een nauwkeurigheid van 90,0%. Dit suggereert dat het gebruik van kunstmatige intelligentie in biosensortechnologie op basis van mobiele telefoons zeer goed mogelijk is.

Figuur 3.(a) Doelklasse van de oplossing die is vastgelegd tijdens de voorbereiding van het monster voor de stap van beeldacquisitie. (b) Voorbeeldafbeelding die is genomen tijdens de stap van beeldacquisitie. (c) Kleurintensiteit van de cyste/AuNPs-oplossing in elke well van de 96-wellsplaat die uit de afbeelding is geëxtraheerd (b).

Met behulp van Cyst/AuNP's hebben onderzoekers met succes een eenvoudig sensorplatform ontwikkeld voor de detectie van methyleringslandschappen en een sensor die normaal DNA van kanker-DNA kan onderscheiden bij gebruik van echte bloedmonsters voor leukemiescreening. De ontwikkelde sensor toonde aan dat DNA, geëxtraheerd uit echte bloedmonsters, in staat was om snel en kosteneffectief kleine hoeveelheden kanker-DNA (3 nM) bij leukemiepatiënten te detecteren in 15 minuten, en toonde een nauwkeurigheid van 95,3%. Om de monsteranalyse verder te vereenvoudigen door de noodzaak van een spectrofotometer te elimineren, werd machine learning gebruikt om de kleur van de oplossing te interpreteren en onderscheid te maken tussen normale en kankerpatiënten met behulp van een foto van een mobiele telefoon. Ook hierbij werd een nauwkeurigheid van 90,0% bereikt.

Referentie: DOI: 10.1039/d2ra05725e