Interferentiefactoren bij PCR-reacties

Tijdens de PCR-reactie worden vaak enkele storende factoren aangetroffen.
Vanwege de zeer hoge gevoeligheid van PCR wordt contaminatie beschouwd als een van de belangrijkste factoren die de PCR-resultaten beïnvloeden en kan deze fout-positieve resultaten opleveren.
Even kritisch zijn de verschillende bronnen die tot fout-negatieve resultaten leiden.Als een of meer essentiële delen van het PCR-mengsel of de amplificatiereactie zelf worden geremd of verstoord, kan de diagnostische test worden belemmerd.Dit kan leiden tot verminderde efficiëntie en zelfs tot fout-negatieve resultaten.
Naast remming kan verlies van doelnucleïnezuurintegriteit optreden als gevolg van transport- en/of opslagomstandigheden voorafgaand aan monsterbereiding.Met name hoge temperaturen of onvoldoende opslag kunnen leiden tot beschadiging van cellen en nucleïnezuren.Cel- en weefselfixatie en paraffine-inbedding zijn bekende oorzaken van DNA-fragmentatie en een hardnekkig probleem (zie figuren 1 en 2).In deze gevallen helpt zelfs optimale isolatie en zuivering niet.

Figuur 1 |Effect van immobilisatie op DNA-integriteit
Agarosegelelektroforese toonde aan dat de kwaliteit van het DNA dat werd geïsoleerd uit paraffinecoupes van autopsies aanzienlijk varieerde.DNA met verschillende gemiddelde fragmentlengtes was aanwezig in de extracten, afhankelijk van de fixatiemethode.DNA werd alleen bewaard wanneer het werd gefixeerd in natieve ingevroren monsters en in gebufferde neutrale formaline.Het gebruik van een sterk zuur Bouin-fixeermiddel of ongebufferde, mierenzuurbevattende formaline resulteerde in een aanzienlijk verlies van DNA.De overige fractie is sterk gefragmenteerd.
Aan de linkerkant wordt de lengte van fragmenten uitgedrukt in kilobaseparen (kbp)

Figuur 2 |Verlies van integriteit van nucleïnezuurdoelen
(a) Een opening van 3′-5′ op beide strengen zal resulteren in een breuk in het doel-DNA.synthese van DNA zal nog steeds plaatsvinden op het kleine fragment.Als er echter een primer-aanhechtingsplaats op het DNA-fragment ontbreekt, vindt alleen lineaire amplificatie plaats.In het meest gunstige geval kunnen de fragmenten elkaar opnieuw verzadigen, maar de opbrengsten zullen klein zijn en onder detectieniveaus liggen.
(b) Verlies van basen, voornamelijk als gevolg van depurinatie en thymidinedimeervorming, leidt tot een afname van het aantal H-bindingen en een afname van de Tm.Tijdens de langgerekte opwarmfase zullen de primers wegsmelten van het matrix-DNA en zelfs onder minder strenge omstandigheden niet versmelten.
(c) Aangrenzende thyminebasen vormen een TT-dimeer.
Een ander veelvoorkomend probleem dat vaak voorkomt in de moleculaire diagnostiek is de niet-optimale afgifte van doelnucleïnezuren in vergelijking met extractie met fenol-chloroform.In extreme gevallen kan dit gepaard gaan met fout-negatieven.Er kan veel tijd worden bespaard door kokende lysis of enzymatische vertering van celresten, maar deze methode resulteert vaak in een lage PCR-gevoeligheid vanwege onvoldoende afgifte van nucleïnezuur.

Remming van polymerase-activiteit tijdens amplificatie

Over het algemeen wordt remming gebruikt als een containerconcept om alle factoren te beschrijven die leiden tot suboptimale PCR-resultaten.In strikt biochemische zin is remming beperkt tot de activiteit van het enzym, dwz het vermindert of verhindert de omzetting van substraat naar product door interactie met de actieve plaats van de DNA-polymerase of zijn cofactor (bijv. Mg2+ voor Taq-DNA-polymerase).
Componenten in het monster of verschillende buffers en extracten die reagentia bevatten, kunnen het enzym direct remmen of zijn cofactoren (bijv. EDTA) vangen, waardoor het polymerase wordt geïnactiveerd en dit op zijn beurt leidt tot verlaagde of fout-negatieve PCR-resultaten.
Veel interacties tussen reactiecomponenten en doelwitbevattende nucleïnezuren worden echter ook wel 'PCR-remmers' genoemd.Zodra de integriteit van de cel is verstoord door isolatie en het nucleïnezuur is vrijgegeven, kunnen interacties tussen het monster en de omringende oplossing en vaste fase optreden.'Scavengers' kunnen bijvoorbeeld enkel- of dubbelstrengs DNA binden via niet-covalente interacties en de isolatie en zuivering verstoren door het aantal doelwitten dat uiteindelijk het PCR-reactievat bereikt te verminderen.
Over het algemeen zijn PCR-remmers aanwezig in de meeste lichaamsvloeistoffen en reagentia die worden gebruikt voor klinische diagnostische tests (ureum in urine, hemoglobine en heparine in bloed), voedingssupplementen (organische componenten, glycogeen, vet, Ca2+-ionen) en componenten in het milieu (fenolen). , zware metalen)

Meer voorkomende PCR-remmers zijn te vinden in bacteriën en eukaryote cellen, niet-doelwit-DNA, DNA-bindende macromoleculen van weefselmatrices en laboratoriumapparatuur zoals handschoenen en plastic.Zuivering van nucleïnezuren tijdens of na extractie is de voorkeursmethode voor het verwijderen van PCR-remmers.
Tegenwoordig kunnen verschillende geautomatiseerde extractieapparatuur veel handmatige protocollen vervangen, maar 100% herstel en/of zuivering van doelen is nooit bereikt.Potentiële remmers kunnen nog aanwezig zijn in de gezuiverde nucleïnezuren of zijn mogelijk al in werking getreden.Er bestaan ​​verschillende strategieën om de impact van remmers te verminderen.De keuze van het juiste polymerase kan een significante invloed hebben op de remmeractiviteit.Andere bewezen methoden om PCR-remming te verminderen, zijn het verhogen van de polymeraseconcentratie of het toepassen van additieven zoals BSA.
Remming van PCR-reacties kan worden aangetoond door het gebruik van interne proceskwaliteitscontrole (IPC).
Zorg ervoor dat alle reagentia en andere oplossingen in de extractiekit, zoals ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, uit het nucleïnezuurisolaat worden verwijderd door een grondige wasstap.Afhankelijk van hun concentratie kunnen ze PCR activeren of remmen.