Uitvoering van vier nucleïnezuuramplificatietesten om SARS-CoV-2 in Ethiopië te identificeren

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel van drie dia's tegelijk.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Sinds de uitbraak van de coronavirusziekte (COVID-19) in 2019 zijn er over de hele wereld veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT's) ontwikkeld die standaardassays zijn geworden.Hoewel er snel verschillende tests werden ontwikkeld en toegepast op diagnostische laboratoriumtests, is de prestatie van deze tests niet in verschillende omgevingen geëvalueerd.Daarom was deze studie gericht op het evalueren van de prestaties van de Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- en Sansure Biotech-assays met behulp van de Composite Reference Standard (CRS).Het onderzoek werd uitgevoerd bij het Ethiopian Public Health Institute (EPHI) van 1 tot 30 december 2020. Er werden 164 nasofaryngeale monsters geëxtraheerd met behulp van de QIAamp RNA-minikit en het Abbott DNA-monstervoorbereidingssysteem.Van 164 monsters was 59,1% positief en 40,9% negatief voor CRS. De positiviteit van Sansure Biotech was significant laag in vergelijking met CRS (p < 0,05). De positiviteit van Sansure Biotech was significant laag in vergelijking met CRS (p < 0,05). De Sansure Biotech-software gebruikt een CRS-systeem (p < 0,05). De positieve resultaten van Sansure Biotech waren aanzienlijk lager in vergelijking met CRS (p < 0,05).Volgens de CRS-methode, de Sansure Biotech-standaard (p < 0,05)。Volgens de CRS-methode, de Sansure Biotech-standaard (p < 0,05)。 Sansure Biotech heeft een aanvraag ingediend bij CRS (p < 0,05). Sansure Biotech had significant minder positieve resultaten in vergelijking met CRS (p < 0,05).De algemene overeenstemming van de vier analyses was 96,3-100% in vergelijking met CRS.Naast het lage positiviteitspercentage van de Sansure Biotech-assay, waren de prestaties van de vier assays bijna vergelijkbaar.Als zodanig vereist de Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-test aanvullende validatie voor gebruik in Ethiopië.Ten slotte moet aanvullend onderzoek worden overwogen om assays met de juiste beweringen van de fabrikant te evalueren.
Laboratoriumtests maken deel uit van het Strategisch Plan voor Coronavirusziekte 2019 (COVID-19) Paraatheid en Reactie (SPRP) van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO).De WHO adviseert dat landen laboratoriumcapaciteit moeten opbouwen om de paraatheid, goed casemanagement, waakzaamheid en snelle reactie op uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid te verbeteren.Dit suggereert dat de rol van het laboratorium de sleutel is tot het karakteriseren van de ziekte en epidemiologie van opkomende infectieuze agentia en het beheersen van hun verspreiding.
De diagnose van COVID-19 vereist epidemiologische en medische informatie, persoonlijke symptomen/tekenen en radiografische en laboratoriumgegevens2.Sinds de uitbraak van COVID-19 werd gemeld in Wuhan, China, zijn er over de hele wereld veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT's) ontwikkeld.Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) is gebruikt als routinematige en standaardmethode voor laboratoriumdiagnose van ernstige acute respiratory syndrome 2 (SARS-CoV-2)3-infectie.Moleculaire detectie van SARS-CoV-2 is typisch gebaseerd op de N-genen (nucleocapside-eiwitgen), E-gen (envelope-eiwitgen) en RdRp-genen (RNA-afhankelijk RNA-polymerasegen) in ORF1a/b (open leeskader 1a/b) .gen) regio geïdentificeerd uit het virale genoom.Ze worden beschouwd als de belangrijkste geconserveerde regio's die in virale genomen worden aangetroffen voor virusherkenning .Van deze genen hebben de RdRp- en E-genen een hoge analytische detectiegevoeligheid, terwijl het N-gen een lage analytische gevoeligheid heeft5.
De prestaties van PCR-assays kunnen variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals: extractiereagentia, amplificatie-/detectiereagentia, extractiemethode, kwaliteit van het PCR-apparaat en andere instrumenten.Sinds april 2020 hebben meer dan 48 verschillende diagnostische apparaten uit negen landen Emergency Use Authorization (EUA) ontvangen voor COVID-196-diagnostiek.In Ethiopië worden meer dan 14 real-time PCR-platforms gebruikt voor PCR-detectie van SARS-CoV-2 bij 26 volksgezondheidsinstellingen, waaronder ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 en Quant-studio7.Daarnaast zijn er verschillende PCR-testkits verkrijgbaar, zoals de Daan Gene-test, de Abbott SARS-CoV-2-test, de Sansure Biotech-test en de SARS-CoV-2 BGI-test.Hoewel rRT-PCR zeer gevoelig is, rapporteren sommige patiënten met COVID-19 vals-negatieve resultaten als gevolg van onvoldoende kopieën van viraal ribonucleïnezuur (RNA) in monsters als gevolg van onjuiste verzameling, transport, opslag en hantering en laboratoriumtests.voorwaarden en acties van personeel8.Bovendien kunnen verkeerd gebruik van monsters of controles, het instellen van de cyclusdrempel (Ct) en kruisreactiviteit met andere pathogene nucleïnezuren of inactief/resterend SARS-CoV-2-RNA leiden tot fout-positieve resultaten in rRT-PCR9-assays.Het is dus duidelijk dat PCR-testen inderdaad dragers van genfragmenten kunnen identificeren, aangezien ze zelfs geen onderscheid kunnen maken tussen echt actieve virale genen, dus de tests kunnen alleen dragers identificeren en geen patiënten10.Daarom is het belangrijk om diagnostische prestaties te beoordelen met behulp van standaardmethoden in onze setting.Hoewel veel NAAT-reagentia verkrijgbaar zijn bij het Ethiopian Public Health Institute (EPHI) en in het hele land, is er nog geen vergelijkende evaluatie van hun effectiviteit gerapporteerd.Daarom was deze studie gericht op het evalueren van de vergelijkende prestaties van in de handel verkrijgbare kits voor de detectie van SARS-CoV-2 door rRT-PCR met behulp van klinische monsters.
In totaal namen 164 deelnemers met verdenking op COVID-19 deel aan deze studie.De meerderheid van de monsters kwam uit behandelcentra (118/164 = 72%), terwijl de overige 46 (28%) deelnemers afkomstig waren uit niet-behandelcentra.Van de deelnemers die niet in het centrum werden behandeld, hadden 15 (9,1%) klinisch verdachte gevallen en 31 (18,9%) contacten met bevestigde gevallen.Drieënnegentig (56,7%) deelnemers waren mannelijk en de gemiddelde (± SD) leeftijd van de deelnemers was 31,10 (± 11,82) jaar.
In deze studie werden positieve en negatieve percentages van vier tests voor COVID-19 bepaald.Zo waren de positieve percentages van de Abbott SARS-CoV-2-assay, Daan Gene 2019-nCoV-assay, SARS-CoV-2 BGI-assay en Sansure Biotech 2019-nCoV-assay respectievelijk 59,1%, 58,5%, 57,9% en 55,5% .De positieve en negatieve samengestelde referentiestandaard (CRS)-scores waren respectievelijk 97 (59,1%) en 67 (40,9%) (Tabel 1).In deze studie was de definitie van CRS gebaseerd op de regel 'elk positief', waarbij van de vier testresultaten twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat opleverden als echt positief of negatief werden beschouwd.
In deze studie vonden we een negatieve procentuele overeenkomst (NPA) van 100% (95% BI 94,6–100) voor alle analyses in vergelijking met CRS.De Sansure Biotechnology-analyse toonde een minimale PPA van 93,8% (95% BI 87,2-97,1) en de Daan Gene 2019-nCoV-analyse had een algemene overeenkomst van 99,4% (95% BI 96,6-99,9).Daarentegen was de algehele overeenstemming tussen de SARS-CoV-2 BGI-assay en de Sansure Biotech 2019-nCoV-assay respectievelijk 98,8% en 96,3% (tabel 2).
Cohen's kappa-coëfficiënt van overeenstemming tussen CRS- en Abbott SARS-CoV-2-assayresultaten was volledig consistent (K = 1,00).Evenzo zijn de kappa-waarden van Cohen gedetecteerd door Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI en Sansure Biotech 2019-nCoV ook volledig consistent met CRS (K ≥ 0,925).In deze vergelijkende analyse toonde de chikwadraattest (McNemar-test) aan dat de resultaten van de Sansure Biotech 2019-nCoV-assay significant verschilden van de CRS-resultaten (p = 0,031) (Tabel 2).
Zoals getoond in Afb.1 het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-assay (gecombineerd RdRp- en N-gen) was 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-assay toonde aan dat het percentage van lage Ct-waarde (< 20 Ct) was 50,3% en de hoge Ct-waarde (36-40 Ct) was 3,2%. 1 het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-assay (gecombineerd RdRp- en N-gen) was 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-assay toonde aan dat het percentage van lage Ct-waarde (< 20 Ct) was 50,3% en de hoge Ct-waarde (36-40 Ct) was 3,2%.Zoals getoond in Afb.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) van 50,3%, en van Ct (36-40 Ct) van 3,2%. 1, het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) analyse van Abbott SARS-CoV-2 (gecombineerd gen RdRp en N) was 87,6%, en de Ct-waarde van ORF1a/b genanalyse van Sansure Biotech 2019-nCoV toonde dat het percentage lage Ct-waarde (<20 Ct) goed was voor 50,3%, en hoge waarde Ct (36-40 Ct) voor 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct Voor (< 20 Ct) tot 50,3%, voor (36-40 Ct) tot 3,2%. Zoals weergegeven in figuur 1, is het laagste Ct-waardepercentage (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (combinatie van RdRp en N-gen) 87,6%, de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toont lage Ct 值(< 20 Ct) 的 percentage is 50,3%, 高Ct 值(36-40 Ct) 的 percentage is 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV met Ct. Zoals weergegeven in afbeelding 1, had de Abbott SARS-CoV-2-assay (een combinatie van de RdRp- en N-genen) de laagste procentuele Ct-waarde (< 20 Ct) van 87,6%, terwijl de Ct-waarde van het ORF1a/b-gen in de Sansure Biotech 2019 studie – De analyse van nCoV toonde een lage Ct. De gemiddelde waarde (< 20 Ct) bedraagt ​​50,3%, en de gemiddelde Ct (36–40 Ct) bedraagt ​​3,2%. Het percentage waarden (< 20 Ct) was 50,3% en het percentage hoge Ct-waarden (36-40 Ct) was 3,2%.De Abbott SARS-CoV-2 B-test registreerde Ct-waarden boven de 30. Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen bij de BGI SARS-CoV-2-assay een hoge Ct-waarde (> 36 Ct) en was het percentage 4% (Fig. 1). Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen bij de BGI SARS-CoV-2-assay een hoge Ct-waarde (> 36 Ct) en was het percentage 4% (Fig. 1). Volgens de gegevens van BGI SARS-CoV-2 veroorzaakte ORF1a/b een hogere Ct (> 36 Ct), met een daling van 4,1%. Aan de andere kant had ORF1a/b bij de analyse van het BGI SARS-CoV-2-gen een hoge Ct-waarde (> 36 Ct), waarvan het percentage 4% was (Fig. 1).Volgens BGI SARS-CoV-2, ORF1a/b en Ct （> 36 Ct） 4% (1) Aan de andere kant is bij BGI SARS-CoV-2-detectie het percentage van het ORF1a/b-gen met een hoge Ct-waarde (>36 Ct) 4% (Figuur 1). Als de kans groot is dat BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b met Ct (>36 Ct) tot 4% (gemiddeld 1) verlaagt. Aan de andere kant was in de BGI SARS-CoV-2-analyse het percentage ORF1a/b-genen met hoge Ct-waarden (>36 Ct) 4% (Fig. 1).
In deze studie hebben we 164 nasofaryngeale monsters genomen.Voor alle soorten assays werd RNA-isolatie en -amplificatie uitgevoerd met behulp van de methoden en kits die door de respectieve fabrikanten werden aanbevolen.
Deze studie toonde aan dat de test van Abbott voor SARS-CoV-2 dezelfde detectieprestaties heeft als CRS, met 100% positieve, negatieve en algehele concordantie.De kappa-overeenkomst van Cohen is 1,00, wat wijst op volledige overeenstemming met CRS.Uit een vergelijkbaar onderzoek van de Universiteit van Washington in de VS bleek dat de algehele sensitiviteit en specificiteit van de Abbott-test voor SARS-CoV-2 respectievelijk 93% en 100% was in vergelijking met de door het laboratorium bepaalde assay (LDA) van de CDC. .11. Het Abbott SARS-CoV-2-detectiesysteem is gebaseerd op de gelijktijdige gecombineerde detectie van de N- en RdRp-genen, aangezien beide genen gevoeliger zijn, waardoor vals-negatieven worden geminimaliseerd12.Een studie in Wenen, Oostenrijk toonde ook aan dat grote extractiemonstervolumes en detectie-eluensvolumes de verdunningseffecten minimaliseerden en de detectie-efficiëntie verhoogden13.De perfecte match van Abbott voor de SARS-CoV-2-test kan dus worden geassocieerd met een platformdetectiesysteem dat gelijktijdig combinatorische genen detecteert, een groot aantal monsters extraheert (0,5 ml) en een grote hoeveelheid eluens gebruikt (40 µl).
Onze resultaten toonden ook aan dat de detectieprestaties van de genetische test van Daan bijna hetzelfde waren als die van CRS.Dit komt overeen met een studie14 uitgevoerd aan de Anhui University in Huainan, China, en de claim van de fabrikant van 100% positieve overeenkomst.Ondanks meldingen van consistente resultaten was één monster vals-negatief na het opnieuw testen van hetzelfde eluaat, maar was het positief in de Abbott SARS-CoV-2- en Sansure Biotech nCoV-2019-assays.Dit suggereert dat de resultaten tussen verschillende soorten assays kunnen variëren. Desalniettemin was het resultaat van de Daan Gene-assay in het onderzoek dat in China werd uitgevoerd15 significant verschillend (p < 0,05) in vergelijking met hun door het laboratorium gedefinieerde referentieassay. Desalniettemin was het resultaat van de Daan Gene-assay in het onderzoek dat in China werd uitgevoerd15 significant verschillend (p < 0,05) in vergelijking met hun door het laboratorium gedefinieerde referentieassay. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа. In een onderzoek in China15 was het analyseresultaat van Daan Gene echter significant verschillend (p < 0,05) van hun laboratoriumreferentieanalyse.Foto's van 15.000 foto's en foto's van de foto's die gemaakt zijn voor <0.0（5.0＂ ， ，Foto's van 15% van de foto's van de foto's die gemaakt zijn om een ​​foto te maken van <0.0.05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. In een studie in China15 waren de resultaten van de genetische test van Daan echter significant verschillend (p < 0,05) in vergelijking met de referentielaboratoriumtest.Deze discrepantie kan te wijten zijn aan de gevoeligheid van de referentietest om SARS-CoV-2 te detecteren, en verder onderzoek kan belangrijk zijn om de oorzaak te achterhalen.
Bovendien evalueerde ons onderzoek de vergelijkende prestaties van de SARS-CoV-2 BGI-assay met CRS, met uitstekende positieve procentuele overeenstemming (PPA = 97,9%), negatieve procentuele overeenstemming (NPA = 100%) en algehele procentuele overeenstemming per geslacht ( OPA).).= 98,8%).Cohen's Kappa-waarden vertoonden een goede overeenkomst (K = 0,975).Studies in Nederland16 en China15 laten consistente resultaten zien.De SARS-CoV-2 BGI-test is een detectietest voor een enkel gen (ORF1a/b) met 10 µl amplificatie/detectie-eluaat.Ondanks een goede statistische overeenkomst met onze referentieresultaten, miste de analyse twee positieve steekproeven (1,22%) van de totale steekproef.Dit kan enorme klinische implicaties hebben voor de transmissiedynamiek op zowel patiënt- als gemeenschapsniveau.
Een andere vergelijkende analyse die in dit onderzoek is opgenomen, was de Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-test;het totale matchpercentage was 96,3%.De sterkte van de overeenstemming werd ook bepaald door de Cohen's Kappa-waarde, die 0,925 was, wat wijst op volledige overeenstemming met de CRS.Nogmaals, onze resultaten zijn identiek aan onderzoeken die zijn uitgevoerd aan de Central South University in Changsha, China, en aan de afdeling Klinisch Laboratorium van het Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, China17. Hoewel de bovengenoemde goede statistische overeenstemming werd geregistreerd, toonde de chikwadraattest (MacNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-assay een statistisch significant verschil vertoonde in vergelijking met CRS (p < 0,005). Hoewel de bovengenoemde goede statistische overeenstemming werd geregistreerd, toonde de chikwadraattest (MacNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-assay een statistisch significant verschil vertoonde in vergelijking met CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Hoewel de bovenstaande goede statistische overeenkomst werd geregistreerd, toonde de chi-kwadraattest (McNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde met de CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS 相比具有统计学显着差异（p < 0.005）。尽管 记录 了 上述 良好 良好 统计 一致 性 性 ， 但 （（（（MacNemar 检验 表明 ，, Sansure Biotech 检测 结果 与 与 与 相比 具有 （（（（（（（（（（（（（（（（（（p <0,005 。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. Ondanks de hierboven genoemde goede statistische overeenkomst, toonde de chi-kwadraattoets (McNemar-toets) een statistisch significant verschil (p < 0,005) tussen de Sansure Biotech-assay en de CRS.Zes monsters (3,66%) bleken vals-negatieven te zijn in vergelijking met CRS (aanvullende tabel 1);dit is erg belangrijk, vooral gezien de dynamiek van de overdracht van het virus.Bovenstaande gegevens ondersteunen ook dit lage detectiepercentage15.
In deze studie werden Ct-waarden bepaald voor elke assay en elk platform, waarbij de laagste gemiddelde Ct-waarde werd gerapporteerd in de Abbott SARS-CoV-2-assay.Dit resultaat kan verband houden met het gelijktijdige gecombineerde genetische testsysteem van Abbott voor de detectie van SARS-CoV-2.Daarom had volgens figuur 1 87,6% van de Abbott SARS-CoV-2-resultaten Ct-waarden onder de 20. Slechts een klein aantal steekproefresultaten (12,4%) viel in het bereik van 20-30.Ct-waarden boven de 30 werden niet geregistreerd.Naast het gebruik door Abbott van het genetische testformaat van het SARS-CoV-2-panel, kan dit resultaat verband houden met de onderste detectielimiet (32,5 RNA-kopieën/ml)18, die drie keer lager is dan de ondergrens van het bedrijf van 100 RNA-kopieën /ml.ml)19.
Deze studie heeft enkele beperkingen: ten eerste hebben we geen standaard-/referentiemethoden [zoals viral load of andere laboratoriumtests (LDA)] vanwege een gebrek aan middelen.Ten tweede waren alle monsters die in dit onderzoek werden gebruikt nasofaryngeale uitstrijkjes, terwijl de resultaten niet van toepassing waren op andere soorten monsters, en ten derde was onze steekproefomvang klein.
Deze studie vergeleek de prestaties van vier rRT-PCR-assays voor SARS-CoV-2 met behulp van nasofaryngeale monsters.Alle detectie-assays hadden bijna vergelijkbare prestaties, met uitzondering van de Sansure Biotech-assay. Bovendien werd het lage positiviteitspercentage geïdentificeerd in de Sansure Biotech-assay in vergelijking met de CRS (p < 0,05). Bovendien werd het lage positiviteitspercentage geïdentificeerd in de Sansure Biotech-assay in vergelijking met de CRS (p < 0,05). Als dit het geval is, kan Sansure Biotech een aanvraag indienen om een ​​CRS-score van <5 (0,0,0) te krijgen. Bovendien liet de Sansure Biotech-test een laag percentage positieve resultaten zien in vergelijking met CRS (p < 0,05).Volgens het CRS-programma, Sansure Biotech-testprogramma (p < 0,05)。Volgens het CRS-programma, Sansure Biotech-testprogramma (p < 0,05)。 Dit is de reden waarom Sansure Biotech een CRS-score van 0,0 (p < 0,5) heeft verkregen. Bovendien had de Sansure Biotech-assay een lager positiviteitspercentage in vergelijking met CRS (p < 0,05).De Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analyse van PPA, NPA en algehele overeenstemming overschreed 93,5% met een Cohen Kappa sterkte van overeenkomstwaarde van 0,925.Ten slotte heeft de Sansure Biotech Assay (RUO) verdere validatie nodig voor gebruik in Ethiopië, en aanvullend onderzoek moet worden overwogen om claims van individuele fabrikanten te evalueren.
Vergelijkende onderzoeksopzet werd uitgevoerd in vier gezondheidscentra in Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital en St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital.De gegevens zijn verzameld tussen 1 en 31 december 2020. De medische voorzieningen voor deze studie zijn bewust gekozen op basis van hun grote aantal gevallen en de beschikbaarheid van grote behandelcentra in de stad.Evenzo werden instrumenten, waaronder de ABI 7500 en Abbott m2000 real-time PCR-instrumenten, geselecteerd volgens de aanbevelingen van de NAAT-reagensfabrikanten, en werden vier PCR-detectiekits geselecteerd voor dit onderzoek, aangezien de meeste laboratoria in Ethiopië minstens vier van hen.gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test en SARS-CoV-2 BGI-test uitgevoerd tijdens het onderzoek).
Testen op SARS-CoV-2 werden uitgevoerd van 1 tot 30 december 2020 met 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) van personen die werden onderzocht op COVID-19, verwezen naar EPHI.Nasofaryngeale monsters werden verzameld door getrainde monsterverzamelaars en in drievoudige pakketten naar EPHI gestuurd.Voorafgaand aan de nucleïnezuurisolatie krijgt elk monster een uniek identificatienummer toegewezen.Extractie van elk monster wordt onmiddellijk na aankomst uitgevoerd met behulp van handmatige en automatische extractiemethoden.Voor de automatische extractie van Abbott m2000 werd dus 1,3 ml (inclusief 0,8 ml dood volume en 0,5 ml extractie-inlaatvolume) van het monster uit elk monster geëxtraheerd en door het Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, VS).) Een batch van 96 [92 monsters, twee detectiecontroles en twee niet-sjablooncontroles (NTC)] werd in realtime opgenomen in het totale proces (ophalen en detecteren) van twee ronden van SARS-CoV-2 (EUA).mijnbouw.Gebruik voor handmatige extractie dezelfde monsters (voor automatische extractie en ontdekking).Zodoende werden tijdens het hele proces 140 µl monsters verdeeld en geëxtraheerd met behulp van de QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland) in batches van 24 (inclusief 20 monsters, twee assaycontroles en twee NTC's) over negen ronden.Handmatig geëxtraheerde eluaten werden geamplificeerd en gedetecteerd met behulp van een ABI 7500 thermal cycler met behulp van de SARS-CoV-2 BGI-assay, de Daan Gene-assay en de Sansure Biotech-assay.
Geautomatiseerde isolatie en zuivering van viraal RNA van SARS-CoV-2 volgt het principe van magnetische korrels met behulp van reagentia voor de voorbereiding van DNA-monsters van Abbott.Inactivering van monsters en solubilisatie van virale deeltjes wordt uitgevoerd met behulp van een detergens dat guanidine-isothiocyanaat bevat om het eiwit te denatureren en RNase te inactiveren.Het RNA wordt vervolgens gescheiden van het eiwit door middel van vastefasescheiding met behulp van silica, dwz het guanidiniumzout en de alkalische pH van de lysisbuffer bevorderen de binding van de nucleïnezuren aan de silica (SiO2).De spoelstap verwijdert resterende eiwitten en vuil om een ​​heldere oplossing te produceren.Transparant RNA wordt geïsoleerd uit op silica gebaseerde microdeeltjes met behulp van het magnetische veld van het instrument20,21.Aan de andere kant wordt handmatige isolatie en zuivering van RNA uitgevoerd door de spinkolommethode met behulp van centrifugatie in plaats van een magnetische standaard en scheiding van microdeeltjes van het eluens.
De real-time SARS-CoV-2-detectietest van Abbott (Abbott Molecular, Inc.) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, die EUA19,22 ontving van de WHO en de FDA.In dit protocol werd monsterinactivatie vóór extractie uitgevoerd in een waterbad bij 56 °C gedurende 30 minuten.Na virusinactivatie werd nucleïnezuurextractie uitgevoerd op een Abbott m2000 SP-instrument van 0,5 ml VTM met behulp van een Abbott m2000 DNA-monstervoorbereidingssysteem.volgens de fabrikant.Amplificatie en detectie werden uitgevoerd met behulp van een Abbott m2000 RT-PCR-instrument en dubbele detectie werd uitgevoerd voor de RdRp- en N-genen.ROX) en VIC P (gepatenteerde kleurstof) voor het richten en detecteren van interne controles, waardoor gelijktijdige detectie van beide amplificatieproducten mogelijk is 19 .
De amplificatiedetectiemethode van deze kit is gebaseerd op eenstaps RT-PCR-technologie.De ORF1a/b- en N-genen werden geselecteerd als geconserveerde regio's door Daan Gene Technology om amplificatie van de doelregio te detecteren.Specifieke primers en fluorescerende probes (N-gen-probes gelabeld met FAM, ORF1a/b-probes gelabeld met VIC) zijn ontworpen om SARS-CoV-2-RNA in monsters te detecteren.Het uiteindelijke eluens en mastermengsels werden bereid door 5 µl eluens toe te voegen aan 20 µl van het mastermengsel tot een uiteindelijk volume van 25 µl.Amplificatie en detectie werden gelijktijdig uitgevoerd op een ABI 750024 real-time PCR-instrument.
De ORF1a/b- en N-genen werden gedetecteerd met behulp van de Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescente PCR-detectie).Bereid specifieke sondes voor elk doelgen voor door het FAM-kanaal voor de ORF1a/b-regio en het ROX-kanaal voor het N-gen te selecteren.Aan deze testkit worden eluens en mastermixreagentia als volgt toegevoegd: bereid 30 µl mastermixreagens en 20 µl geëlueerd monster voor detectie/amplificatie.Realtime PCR ABI 750025 werd gebruikt voor amplificatie/detectie.
De SARS-CoV-2 BGI-test is een fluorescerende real-time rRT-PCR-kit voor de diagnose van COVID-19.Het doelgebied bevindt zich in het ORF1a/b-gebied van het SARS-CoV-2-genoom, een detectiemethode voor een enkel gen.Bovendien is het menselijke huishoudelijke gen β-actine een intern gereguleerd doelwitgen.De mastermix wordt bereid door 20 µl van het mastermixreagens en 10 µl van het geëxtraheerde RNA-monster te mengen in een putjesplaat26.Een ABI 7500 fluorescerend kwantitatief real-time PCR-instrument werd gebruikt voor amplificatie en detectie.Alle nucleïnezuuramplificatie, PCR-runcondities voor elke assay en interpretatie van resultaten werden uitgevoerd volgens de instructies van de respectieve fabrikant (Tabel 3).
In deze vergelijkende analyse hebben we de referentiestandaardmethode niet gebruikt om het percentage overeenstemming (positief, negatief en algemeen) en andere vergelijkingsparameters voor de vier analyses te bepalen.Elke testvergelijking werd gedaan met CRS, in deze studie werd de CRS bepaald door de regel "elk positief" en het resultaat werd bepaald, niet door een enkele test, we gebruikten ten minste twee overeenkomende testresultaten.Bovendien zijn vals-negatieve resultaten in het geval van COVID-19-overdracht gevaarlijker dan vals-positieve resultaten.Om zo nauwkeurig mogelijk "positief" te zeggen op basis van een CRS-resultaat, moeten daarom ten minste twee assaytests positief zijn, wat betekent dat er waarschijnlijk ten minste één positief resultaat afkomstig is van een EUA-assay.Van de vier testresultaten worden dus twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat geven als echt positief of negatief beschouwd18,27.
Gegevens werden verzameld met behulp van gestructureerde gegevensextractieformulieren, gegevensinvoer en analyse werden uitgevoerd met behulp van Excel statistische software en SPSS versie 23.0 voor beschrijvende statistieken.Positieve, negatieve en algehele procentuele overeenstemming werden geanalyseerd en een Kappa-score werd gebruikt om de mate van overeenstemming van elke methode met CRS te bepalen.Kappa-waarden worden als volgt geïnterpreteerd: 0,01 tot 0,20 voor lichte overeenstemming, 0,21 tot 0,40 voor algemene overeenstemming, 0,41-0,60 voor matige overeenstemming, 0,61-0,80 voor grote overeenstemming en 0,81-0,99 voor volledige overeenstemming28.
Ethische goedkeuring werd verkregen van de Universiteit van Addis Abeba en alle experimentele protocollen voor deze studie werden goedgekeurd door de Scientific Ethics Review Board van het Ethiopian Public Health Institute.Het referentienummer voor de EPHI Ethics License is EPHI/IRB-279-2020.Alle methoden werden toegepast in overeenstemming met de aanbevelingen en bepalingen van de Ethiopian National Comprehensive Guidelines for the Treatment of COVID-19.Bovendien werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle studiedeelnemers voorafgaand aan deelname aan de studie.
Alle gegevens die in dit onderzoek zijn verkregen of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel.Gegevens ter ondersteuning van de resultaten van deze studie zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de respectieve auteur.
Wereldgezondheidsorganisatie.Aanbevelingen voor laboratoriumteststrategieën voor COVID-19: tussentijdse leidraad, 21 maart 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 slimme diagnose op de Spoedeisende Hulp: All-in in de Praktijk. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 slimme diagnose op de Spoedeisende Hulp: All-in in de Praktijk.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. en Gurgulianis, KI Intelligente diagnose van COVID-19 op de afdeling spoedeisende hulp: alles in de praktijk.Muliou DS, Pantazopoulos I. en Gurgulyanis KI Intelligente diagnose van COVID-19 op spoedeisende hulp: end-to-end integratie in de praktijk.Deskundige dominee Respire.geneesmiddel.3, 263-272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test. Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell, SL en St. George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell SL en St. George K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.J. Klinisch.Virus.128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO.Laboratoriumdetectie van coronavirusziekte 2019 (COVID-19) bij vermoedelijke ziekten bij de mens.https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (geraadpleegd op 15 augustus 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al.COVID-19-diagnose: ziekten en testtools.ACS Nano 14(4), 3822-3835 (2020).
Syed S. et al.Oprichting van het College van Pathologen van Oost-, Centraal- en Zuid-Afrika - Regionale School voor Pathologie van het Midden-Oosten en Zuid-Afrika.Afrika.J. Lab.geneesmiddel.9(1), 1-8 (2020).
Ethiopisch Instituut voor Volksgezondheid, Federaal Ministerie van Volksgezondheid.Tussentijdse Nationale Strategie en Richtlijn voor Laboratoriumdiagnose van COVID-19.https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (geraadpleegd op 12 augustus 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Fout-negatieve tests voor SARS-CoV-2-infectie-uitdagingen en implicaties. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Fout-negatieve tests voor SARS-CoV-2-infectie-uitdagingen en implicaties.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor SARS-CoV-2-infecties en de gevolgen daarvan.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor provocatie en de impact van SARS-CoV-2-infectie.N. eng.J. Geneeskunde.383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en fout-negatieve COVID-19-gevallen: strategieën voor ademhalingspreventie en -beheer, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en fout-negatieve COVID-19-gevallen: strategieën voor ademhalingspreventie en -beheer, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегии лечения, вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en fout-negatieve gevallen van COVID-19: respiratoire preventie en behandelingsstrategieën, vaccinatie en de weg vooruit.Muliu, DS en Gurgulianis, KI Vals-positieve en fout-negatieve gevallen van COVID-19: strategieën voor respiratoire preventie en behandeling, vaccinatie en de weg vooruit.Deskundige dominee Respire.geneesmiddel.15(8), 993-1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: de boom zien maar het bos verliezen. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: de boom zien maar het bos verliezen.Mouliou, DS, Ioannis, P. en Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: zie de boom, verlies het bos.Muliou DS, Ioannis P. en Konstantinos G. COVID-19-diagnose op spoedeisende hulp: door de bomen niet genoeg bos.Tevoorschijn komen.geneesmiddel.J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al.Validatie en validatie van de analytische en klinische prestaties van de Abbott RealTime SARS-CoV-2-assay.J. Klinisch.Virus.129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. en Aflatunyan, B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van 5 verschillende genetische regio's van COVID-19 voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. en Aflatunyan B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Iran.J. Microbiologie.12(3), 185 (2020).
Görtzer, I. et al.Voorlopige resultaten van het landelijke externe kwaliteitsbeoordelingsprogramma voor de detectie van SARS-CoV-2-genoomsequenties.J. Klinisch.Virus.129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al.Analytische evaluatie van de werkzaamheid van vijf RT-PCR-kits voor ernstig acuut ademhalingssyndroom Coronavirus 2. J. Clinical.laboratorium.anus.35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al.Evaluatie van zeven in de handel verkrijgbare SARS-CoV-2 RNA-detectiekits in China op basis van real-time polymerasekettingreactie (PCR).klinisch.Chemisch.laboratorium.geneesmiddel.58(9), e149-e153 (2020).
van Casteren, PB et al.Vergelijking van zeven commerciële RT-PCR COVID-19 diagnostische kits.J. Klinisch.Virus.128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al.Vergelijking van diagnostische prestaties van twee PCR-kits voor de detectie van SARS-CoV-2-nucleïnezuren.J. Klinisch.laboratorium.anus.34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, enz. Een vergelijkend onderzoek van vier SARS-CoV-2 nucleïnezuuramplificatietestplatforms (NAAT) toonde aan dat de prestaties van ID NOW aanzienlijk verslechterden, afhankelijk van de patiënt en het type monster.diagnose.microbiologie.Infecteren.diss.99(1), 115200 (2021).
Abbott-molecuul.Abbott real-time SARS-CoV-2-analysepakketbijsluiter.https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay.1-12.(Vanaf 10 augustus 2020) (2020).
Klein, S. et al.SARS-CoV-2 RNA-isolatie met behulp van magnetische korrels voor snelle grootschalige detectie door RT-qPCR en RT-LAMP.Virus 12(8), 863 (2020).