Interferentiefactoren bij PCR-reacties

Tijdens de PCR-reactie worden vaak enkele interfererende factoren aangetroffen.
Vanwege de zeer hoge gevoeligheid van PCR wordt contaminatie beschouwd als een van de belangrijkste factoren die de PCR-resultaten beïnvloeden en kan dit vals-positieve resultaten opleveren.
Even kritisch zijn de verschillende bronnen die tot vals-negatieve resultaten leiden. Als een of meer essentiële delen van het PCR-mengsel of de amplificatiereactie zelf worden geremd of verstoord, kan de diagnostische test worden belemmerd. Dit kan leiden tot verminderde efficiëntie en zelfs vals-negatieve resultaten.
Naast remming kan verlies van de integriteit van het doelnucleïnezuur optreden als gevolg van transport- en/of opslagomstandigheden voorafgaand aan monstervoorbereiding. Met name hoge temperaturen of onvoldoende opslag kunnen leiden tot schade aan cellen en nucleïnezuren. Cel- en weefselfixatie en paraffine-inbedding zijn bekende oorzaken van DNA-fragmentatie en een hardnekkig probleem (zie figuren 1 en 2). In deze gevallen zal zelfs optimale isolatie en zuivering niet helpen.

Figuur 1 | Effect van immobilisatie op de DNA-integriteit
Agarosegelelektroforese toonde aan dat de kwaliteit van het DNA dat werd geïsoleerd uit paraffinecoupes van autopsies aanzienlijk varieerde. Afhankelijk van de fixatiemethode was DNA met verschillende gemiddelde fragmentlengtes in de extracten aanwezig. DNA werd alleen bewaard als het werd gefixeerd in natieve bevroren monsters en in gebufferde neutrale formaline. Het gebruik van een sterk zuur Bouin-fixeermiddel of ongebufferde, mierenzuurhoudende formaline resulteerde in een aanzienlijk verlies van DNA. De overige fractie is zeer gefragmenteerd.
Aan de linkerkant wordt de lengte van fragmenten uitgedrukt in kilobaseparen (kbp)

Figuur 2 | Verlies van integriteit van nucleïnezuurdoelen
(a) Een 3′-5′-opening op beide strengen zal resulteren in een breuk in het doel-DNA. synthese van DNA zal nog steeds plaatsvinden op het kleine fragment. Als er echter een primer-annealingsplaats op het DNA-fragment ontbreekt, vindt er alleen lineaire amplificatie plaats. In het gunstigste geval kunnen de fragmenten elkaar opnieuw verzadigen, maar de opbrengsten zullen klein zijn en onder detectieniveaus.
(b) Verlies van basen, voornamelijk als gevolg van depurinatie en vorming van thymidinedimeer, leidt tot een afname van het aantal H-bindingen en een afname van Tm. Tijdens de verlengde opwarmfase zullen de primers wegsmelten van het matrix-DNA en zullen ze zelfs onder minder stringente omstandigheden niet uitharden.
(c) Aangrenzende thyminebasen vormen een TT-dimeer.
Een ander veelvoorkomend probleem dat vaak voorkomt bij moleculaire diagnostiek is de minder dan optimale afgifte van doelnucleïnezuren vergeleken met fenol-chloroformextractie. In extreme gevallen kan dit gepaard gaan met valse negatieven. Er kan veel tijd worden bespaard door lyse door koken of enzymatische vertering van celresten, maar deze methode resulteert vaak in een lage PCR-gevoeligheid als gevolg van onvoldoende afgifte van nucleïnezuren.

Remming van polymeraseactiviteit tijdens amplificatie

Over het algemeen wordt remming gebruikt als containerconcept om alle factoren te beschrijven die tot suboptimale PCR-resultaten leiden. In strikt biochemische zin is de remming beperkt tot de activiteit van het enzym, dwz het vermindert of verhindert de conversie van substraat naar product door interactie met de actieve plaats van het DNA-polymerase of zijn cofactor (bijv. Mg2+ voor Taq DNA-polymerase).
Componenten in het monster of verschillende buffers en extracten die reagentia bevatten, kunnen het enzym direct remmen of de cofactoren ervan vangen (bijv. EDTA), waardoor het polymerase wordt geïnactiveerd en op zijn beurt leidt tot verminderde of vals-negatieve PCR-resultaten.
Veel interacties tussen reactiecomponenten en doelbevattende nucleïnezuren worden echter ook wel 'PCR-remmers' genoemd. Zodra de integriteit van de cel door isolatie wordt verstoord en het nucleïnezuur wordt vrijgegeven, kunnen interacties tussen het monster en de omringende oplossing en de vaste fase optreden. 'Aaseters' kunnen bijvoorbeeld enkel- of dubbelstrengs DNA binden via niet-covalente interacties en de isolatie en zuivering verstoren door het aantal doelwitten dat uiteindelijk het PCR-reactievat bereikt te verminderen.
Over het algemeen zijn PCR-remmers aanwezig in de meeste lichaamsvloeistoffen en reagentia die worden gebruikt voor klinische diagnostische tests (ureum in urine, hemoglobine en heparine in bloed), voedingssupplementen (organische componenten, glycogeen, vet, Ca2+-ionen) en componenten in het milieu (fenolen , zware metalen)

Meer voorkomende PCR-remmers kunnen worden aangetroffen in bacteriën en eukaryote cellen, niet-doelwit-DNA, DNA-bindende macromoleculen van weefselmatrices en laboratoriumapparatuur zoals handschoenen en plastic. Zuivering van nucleïnezuren tijdens of na extractie is de voorkeursmethode voor het verwijderen van PCR-remmers.
Tegenwoordig kunnen verschillende geautomatiseerde extractieapparatuur veel handmatige protocollen vervangen, maar 100% herstel en/of zuivering van doelen is nooit bereikt. Mogelijke remmers kunnen nog steeds aanwezig zijn in de gezuiverde nucleïnezuren of kunnen al effect hebben gehad. Er bestaan ​​verschillende strategieën om de impact van remmers te verminderen. De keuze van het geschikte polymerase kan een aanzienlijke invloed hebben op de activiteit van de remmende stof. Andere bewezen methoden om PCR-remming te verminderen zijn het verhogen van de polymeraseconcentratie of het toepassen van additieven zoals BSA.
Remming van PCR-reacties kan worden aangetoond door het gebruik van interne proceskwaliteitscontrole (IPC).
Er moet voor worden gezorgd dat alle reagentia en andere oplossingen in de extractiekit, zoals ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, door een grondige wasstap uit het nucleïnezuurisolaat worden verwijderd. Afhankelijk van hun concentratie kunnen ze PCR activeren of remmen.