Interferentiefactoren bij PCR -reacties

Tijdens de PCR -reactie worden vaak enkele interfererende factoren aangetroffen.
Vanwege de zeer hoge gevoeligheid van PCR wordt verontreiniging beschouwd als een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de PCR -resultaten en kunnen ze vals -positieve resultaten opleveren.
Even kritisch zijn de verschillende bronnen die leiden tot vals-negatieve resultaten. Als een of meer essentiële delen van het PCR -mengsel of de versterkingsreactie zelf worden geremd of verstoord, kan de diagnostische test worden gehinderd. Dit kan leiden tot verminderde efficiëntie en zelfs vals negatieve resultaten.
Naast remming kan het verlies van de integriteit van de doelnucleïnezuur optreden als gevolg van verzend- en/of opslagomstandigheden voorafgaand aan de voorbereiding van het monster. In het bijzonder kunnen hoge temperaturen of onvoldoende opslag leiden tot schade van cellen en nucleïnezuren. Cel- en weefselfixatie en paraffine -inbedding zijn bekende oorzaken van DNA -fragmentatie en een persistent probleem (zie figuren 1 en 2). In deze gevallen zal zelfs optimale isolatie en zuivering niet helpen.

Figuur 1 | Effect van immobilisatie op DNA -integriteit
Agarosegelelektroforese toonde aan dat de kwaliteit van het DNA geïsoleerd uit paraffinesecties van autopsies aanzienlijk varieerde. DNA van verschillende gemiddelde fragmentlengtes was aanwezig in de extracten, afhankelijk van de fixatiemethode. DNA werd alleen bewaard wanneer gefixeerd in native bevroren monsters en in gebufferde neutrale formaline. Het gebruik van een sterk zure bouine fixeermiddel of ongebufferd, forminezuurhoudende formaline resulteerde in een aanzienlijk verlies van DNA. De resterende fractie is sterk gefragmenteerd.
Aan de linkerkant wordt de lengte van fragmenten uitgedrukt in kilobaseparen (KBP)

Figuur 2 | Verlies van integriteit van nucleïnezuurdoelen
(A) Een kloof van 3'-5 ′ op beide strengen zal resulteren in een breuk in het doel-DNA. Synthese van DNA zal nog steeds optreden op het kleine fragment. Als er echter een primer -gloeisite ontbreekt op het DNA -fragment, treedt alleen lineaire amplificatie op. In het meest gunstige geval kunnen de fragmenten elkaar opnieuw verzatten, maar de opbrengsten zullen klein en onder de detectieniveaus zijn.
(b) Verlies van basen, voornamelijk als gevolg van de vorming van de depurinatie en thymidinedimeer, leidt tot een afname van het aantal H-bindingen en een afname van TM. Tijdens de langwerpige opwarmfase zullen de primers wegsmelten van het matrix -DNA en zullen ze zelfs niet worden gegloeid onder minder stringente omstandigheden.
(c) aangrenzende thymine -basen vormen een TT -dimeer.
Een ander veel voorkomend probleem dat vaak voorkomt bij moleculaire diagnostiek is de minder dan optimale afgifte van doelnucleïnezuren in vergelijking met fenol-chloroformextractie. In extreme gevallen kan dit worden geassocieerd met valse negatieven. Veel tijd kan worden bespaard door kokende lysis of enzymatische digestie van celafval, maar deze methode resulteert vaak in lage PCR -gevoeligheid als gevolg van onvoldoende afgifte van nucleïnezuur.

Remming van polymerase -activiteit tijdens amplificatie

Over het algemeen wordt remming gebruikt als een containerconcept om alle factoren te beschrijven die leiden tot suboptimale PCR -resultaten. In strikt biochemische zin is remming beperkt tot de activiteit van het enzym, dat wil zeggen, het vermindert of voorkomt het substraatproductomzetting door interactie met de actieve plaats van het DNA-polymerase of de cofactor ervan (bijv. Mg2+ voor Taq DNA-polymerase).
Componenten in het monster of verschillende buffers en extracten die reagentia bevatten, kunnen het enzym direct remmen of zijn cofactoren (bijv. EDTA) vangen, waardoor het polymerase wordt geïnactiveerd en op zijn beurt leidt tot verminderde of vals negatieve PCR -resultaten.
Veel interacties tussen reactiecomponenten en doelbattende nucleïnezuren worden echter ook aangeduid als 'PCR-remmers'. Zodra de integriteit van de cel wordt verstoord door isolatie en het nucleïnezuur wordt vrijgegeven, kunnen interacties tussen het monster en de omliggende oplossing en vaste fase optreden. 'SCAVENGERS' kan bijvoorbeeld een- of dubbelstrengs DNA binden door niet-covalente interacties en interfereren met isolatie en zuivering door het aantal doelen te verminderen dat uiteindelijk het PCR-reactievat bereikt.
In het algemeen zijn PCR -remmers aanwezig in de meeste lichaamsvloeistoffen en reagentia die worden gebruikt voor klinische diagnostische tests (urine in urine, hemoglobine en heparine in bloed), voedingssupplementen (organische componenten, glycogeen, vet, Ca2+ ionen) en componenten in het milieu (fenols (fenols (fenols (fenolen in het milieu (fenols (fenolen (fenolen in het milieu (fenols (fenolen in het milieu (fenols (fenols (fenolen in de omgeving (fenols (fenols in het milieu (fenols (fenols (fenolen in de omgeving (fenols (fenols (fenolen in de omgeving (fenols (fenols (fenolen in het milieu (de omgeving (fenols (fenols (fenolen , zware metalen)

Meer voorkomende PCR-remmers kunnen worden gevonden in bacteriën en eukaryotische cellen, niet-doel-DNA, DNA-bindende macromoleculen van weefselmatrices en laboratoriumapparatuur zoals handschoenen en kunststoffen. Zuivering van nucleïnezuren tijdens of na extractie is de voorkeursmethode voor het verwijderen van PCR -remmers.
Tegenwoordig kunnen verschillende geautomatiseerde extractieapparatuur veel handmatige protocollen vervangen, maar 100% herstel en/of zuivering van doelen is nooit bereikt. Potentiële remmers kunnen nog steeds aanwezig zijn in de gezuiverde nucleïnezuren of kunnen al van kracht zijn genomen. Verschillende strategieën bestaan ​​om de impact van remmers te verminderen. De keuze van de juiste polymerase kan een significante impact hebben op de remmeractiviteit. Andere bewezen methoden om PCR -remming te verminderen, verhogen de polymeraseconcentratie of het toepassen van additieven zoals BSA.
Remming van PCR -reacties kan worden aangetoond door het gebruik van interne proceskwaliteitscontrole (IPC).
Er moet voor worden gezet om alle reagentia en andere oplossingen in de extractiekit te verwijderen, zoals ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol en fenol, van het nucleïnezuurisolaat door een grondige wasstap. Afhankelijk van hun concentratie kunnen ze PCR activeren of remmen.