Interferentiefactoren in PCR-reacties

Tijdens de PCR-reactie kunnen zich vaak storende factoren voordoen.
Vanwege de zeer hoge gevoeligheid van PCR wordt contaminatie beschouwd als een van de belangrijkste factoren die de PCR-resultaten beïnvloeden en tot vals-positieve resultaten kunnen leiden.
Eveneens cruciaal zijn de verschillende oorzaken die tot vals-negatieve resultaten kunnen leiden. Als een of meer essentiële onderdelen van het PCR-mengsel of de amplificatiereactie zelf worden geremd of verstoord, kan de diagnostische test worden belemmerd. Dit kan leiden tot een verminderde efficiëntie en zelfs tot vals-negatieve resultaten.
Naast inhibitie kan verlies van de integriteit van het doelwit-nucleïnezuur optreden als gevolg van transport- en/of opslagomstandigheden voorafgaand aan de monstervoorbereiding. Met name hoge temperaturen of onvoldoende opslag kunnen leiden tot beschadiging van cellen en nucleïnezuren. Fixatie van cellen en weefsels en inbedding in paraffine zijn bekende oorzaken van DNA-fragmentatie en een hardnekkig probleem (zie figuren 1 en 2). In deze gevallen biedt zelfs optimale isolatie en zuivering geen uitkomst.

Figuur 1 | Effect van immobilisatie op de integriteit van het DNA
Agarosegelelektroforese toonde aan dat de kwaliteit van het DNA dat uit paraffinecoupes van autopsies werd geïsoleerd, aanzienlijk varieerde. Afhankelijk van de fixatiemethode was er DNA met verschillende gemiddelde fragmentlengtes aanwezig in de extracten. DNA bleef alleen behouden bij fixatie in natieve bevroren monsters en in gebufferde neutrale formaline. Het gebruik van een sterk zure Bouin-fixeeroplossing of ongebufferde formaline met mierenzuur resulteerde in een significant verlies van DNA. De resterende fractie is sterk gefragmenteerd.
Aan de linkerkant wordt de lengte van de fragmenten weergegeven in kilobaseparen (kbp).

Figuur 2 | Verlies van integriteit van nucleïnezuurdoelen
(a) Een 3'-5'-opening op beide strengen zal resulteren in een breuk in het doel-DNA. De DNA-synthese zal nog steeds plaatsvinden op het kleine fragment. Als er echter een primerbindingsplaats ontbreekt op het DNA-fragment, vindt alleen lineaire amplificatie plaats. In het meest gunstige geval kunnen de fragmenten elkaar opnieuw verzadigen, maar de opbrengst zal klein zijn en onder de detectiegrens liggen.
(b) Verlies van basen, voornamelijk als gevolg van depurinatie en de vorming van thymidinedimeren, leidt tot een afname van het aantal waterstofbruggen en een afname van de smelttemperatuur (Tm). Tijdens de verlengde opwarmfase zullen de primers loskomen van het matrix-DNA en zelfs onder minder strenge omstandigheden niet meer aanhechten.
(c) Aangrenzende thyminebasen vormen een TT-dimeer.
Een ander veelvoorkomend probleem bij moleculaire diagnostiek is de minder dan optimale vrijgave van de doelnucleïnezuren in vergelijking met fenol-chloroformextractie. In extreme gevallen kan dit leiden tot vals-negatieve resultaten. Door lysering door koken of enzymatische digestie van celresten kan veel tijd worden bespaard, maar deze methode resulteert vaak in een lage PCR-gevoeligheid vanwege onvoldoende vrijgave van nucleïnezuren.

Remming van de polymerase-activiteit tijdens amplificatie

In het algemeen wordt inhibitie gebruikt als een overkoepelend concept voor alle factoren die leiden tot suboptimale PCR-resultaten. In strikt biochemische zin is inhibitie beperkt tot de activiteit van het enzym, dat wil zeggen dat het de substraat-productomzetting vermindert of verhindert door interactie met de actieve plaats van het DNA-polymerase of de cofactor ervan (bijvoorbeeld Mg2+ voor Taq DNA-polymerase).
Bestanddelen in het monster of diverse buffers en extracten die reagentia bevatten, kunnen het enzym rechtstreeks remmen of de cofactoren ervan binden (bijv. EDTA), waardoor het polymerase wordt geïnactiveerd en dit op zijn beurt leidt tot verlaagde of vals-negatieve PCR-resultaten.
Veel interacties tussen reactiecomponenten en nucleïnezuren die het doelwit bevatten, worden echter ook aangeduid als 'PCR-remmers'. Zodra de integriteit van de cel door isolatie wordt verstoord en het nucleïnezuur vrijkomt, kunnen er interacties optreden tussen het monster en de omringende oplossing en vaste fase. Zo kunnen 'vangstoffen' enkel- of dubbelstrengs DNA binden via niet-covalente interacties en de isolatie en zuivering verstoren door het aantal doelwitten dat uiteindelijk het PCR-reactievat bereikt te verminderen.
PCR-remmers zijn over het algemeen aanwezig in de meeste lichaamsvloeistoffen en reagentia die worden gebruikt voor klinische diagnostische tests (ureum in urine, hemoglobine en heparine in bloed), voedingssupplementen (organische componenten, glycogeen, vet, Ca2+-ionen) en componenten in het milieu (fenolen, zware metalen).

PCR-remmers komen vaker voor in bacteriën en eukaryotische cellen, niet-doelwit-DNA, DNA-bindende macromoleculen van weefselmatrices en laboratoriumapparatuur zoals handschoenen en kunststoffen. Zuivering van nucleïnezuren tijdens of na extractie is de voorkeursmethode om PCR-remmers te verwijderen.
Tegenwoordig kunnen diverse geautomatiseerde extractieapparaten veel handmatige protocollen vervangen, maar een 100% herstel en/of zuivering van de doelwitten is nog nooit bereikt. Potentiële remmers kunnen nog steeds aanwezig zijn in de gezuiverde nucleïnezuren of hun werking al hebben uitgeoefend. Er bestaan ​​verschillende strategieën om de impact van remmers te verminderen. De keuze van het juiste polymerase kan een aanzienlijke invloed hebben op de activiteit van de remmer. Andere beproefde methoden om PCR-remming te verminderen zijn het verhogen van de polymeraseconcentratie of het toevoegen van additieven zoals BSA.
De remming van PCR-reacties kan worden aangetoond door middel van interne proceskwaliteitscontrole (IPC).
Het is van groot belang alle reagentia en andere oplossingen in de extractiekit, zoals ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol en fenol, grondig te verwijderen van het nucleïnezuurisolaat door middel van een uitgebreide wasstap. Afhankelijk van hun concentratie kunnen ze PCR activeren of remmen.