Prestaties van vier nucleïnezuuramplificatie-onderzoeken om SARS-CoV-2 in Ethiopië te identificeren

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Sinds de uitbraak van het coronavirus (COVID-19) in 2019 zijn wereldwijd veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT's) ontwikkeld en standaardtests geworden. Hoewel verschillende tests snel werden ontwikkeld en toegepast in diagnostische laboratoriumtests, is de prestatie van deze tests niet geëvalueerd in verschillende settings. Daarom was deze studie gericht op het evalueren van de prestaties van de Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI en Sansure Biotech-tests met behulp van de Composite Reference Standard (CRS). De studie werd uitgevoerd bij het Ethiopian Public Health Institute (EPHI) van 1 tot en met 30 december 2020. 164 neuskeelholtemonsters werden geëxtraheerd met behulp van de QIAamp RNA mini kit en het Abbott DNA-monsterbereidingssysteem. Van de 164 monsters was 59,1% positief en 40,9% negatief voor CRS. De positiviteit van Sansure Biotech was significant lager vergeleken met CRS (p < 0,05). De positiviteit van Sansure Biotech was significant lager vergeleken met CRS (p < 0,05). De resultaten van Sansure Biotech zijn niet geschikt voor CRS (p < 0,05). De positieve resultaten van Sansure Biotech waren aanzienlijk lager vergeleken met CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 Sansure Biotech heeft een positief effect op het CRS-niveau (p < 0,05). Sansure Biotech had aanzienlijk minder positieve resultaten vergeleken met CRS (p < 0,05).De algehele overeenstemming van de vier analyses was 96,3-100% vergeleken met CRS. Naast het lage positiviteitspercentage van de Sansure Biotech-test, waren de prestaties van de vier tests vrijwel vergelijkbaar. Daarom vereist de Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-test aanvullende validatie voor gebruik in Ethiopië. Tot slot dient aanvullend onderzoek te worden overwogen om tests met de juiste claims van de fabrikant te evalueren.
Laboratoriumtests maken deel uit van het Strategisch Plan voor de Paraatheid en Respons op Coronavirusziekte 2019 (COVID-19) (SPRP) van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). De WHO adviseert landen om laboratoriumcapaciteit op te bouwen om de paraatheid, het juiste casemanagement, de waakzaamheid en de snelle respons op uitdagingen voor de volksgezondheid te verbeteren. Dit suggereert dat de rol van het laboratorium cruciaal is bij het karakteriseren van de ziekte en de epidemiologie van opkomende infectieuze agentia en het beheersen van de verspreiding ervan.
De diagnose van COVID-19 vereist epidemiologische en medische informatie, persoonlijke symptomen/tekenen en radiografische en laboratoriumgegevens2. Sinds de COVID-19-uitbraak in Wuhan, China, zijn er wereldwijd veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT's) ontwikkeld. Realtime reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) wordt gebruikt als routinematige en standaardmethode voor laboratoriumdiagnostiek van SARS-CoV-2-infecties (severe acute respiratory syndrome 2)3. Moleculaire detectie van SARS-CoV-2 is doorgaans gebaseerd op de genen N (nucleocapside-eiwitgen), E (envelope-eiwitgen) en RdRp (RNA-afhankelijk RNA-polymerasegen) in de regio van het ORF1a/b (open reading frame 1a/b)-gen, geïdentificeerd in het virale genoom. Deze regio's worden beschouwd als de belangrijkste geconserveerde regio's in virale genomen voor virusherkenning4. Van deze genen hebben de genen RdRp en E een hoge analytische detectiegevoeligheid, terwijl het gen N een lage analytische gevoeligheid heeft5.
De prestaties van PCR-tests kunnen variëren afhankelijk van diverse factoren, zoals extractiereagentia, amplificatie-/detectiereagentia, extractiemethode, kwaliteit van de PCR-machine en andere instrumenten. Sinds april 2020 hebben meer dan 48 verschillende diagnostische apparaten uit negen landen een noodvergunning (Emergency Use Authorization, EUA) ontvangen voor COVID-196-diagnostiek. In Ethiopië worden meer dan 14 realtime PCR-platforms gebruikt voor PCR-detectie van SARS-CoV-2 in 26 volksgezondheidsinstellingen, waaronder ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 en Quant-studio7. Daarnaast zijn er diverse PCR-testkits beschikbaar, zoals de Daan Gene-test, de Abbott SARS-CoV-2-test, de Sansure Biotech-test en de SARS-CoV-2 BGI-test. Hoewel rRT-PCR zeer gevoelig is, melden sommige patiënten met COVID-19 vals-negatieve resultaten als gevolg van onvoldoende kopieën van viraal ribonucleïnezuur (RNA) in monsters als gevolg van onjuiste verzameling, transport, opslag en behandeling, en laboratoriumtests. omstandigheden en handelingen van personeel8. Bovendien kunnen verkeerde behandeling van monsters of controles, het instellen van de cyclusdrempel (Ct) en kruisreactiviteit met andere pathogene nucleïnezuren of inactief/resterend SARS-CoV-2-RNA leiden tot vals-positieve resultaten in rRT-PCR9-tests. Het is dus duidelijk dat PCR-tests inderdaad dragers van genfragmenten kunnen identificeren, omdat ze niet eens onderscheid kunnen maken tussen echt actieve virale genen, waardoor de tests alleen dragers kunnen identificeren en geen patiënten10. Daarom is het belangrijk om de diagnostische prestaties te beoordelen met behulp van standaardmethoden in onze setting. Hoewel veel NAAT-reagentia beschikbaar zijn bij het Ethiopian Public Health Institute (EPHI) en in de rest van het land, is er nog geen vergelijkende evaluatie van hun effectiviteit gerapporteerd. Daarom was het doel van deze studie om de vergelijkende prestaties te evalueren van commercieel verkrijgbare kits voor de detectie van SARS-CoV-2 door middel van rRT-PCR met behulp van klinische monsters.
In totaal namen 164 deelnemers met een vermoedelijke COVID-19-besmetting deel aan deze studie. De meeste monsters waren afkomstig uit behandelcentra (118/164 = 72%), terwijl de overige 46 (28%) deelnemers afkomstig waren uit niet-behandelcentra. Van de deelnemers die niet in het centrum werden behandeld, hadden 15 (9,1%) klinisch verdachte gevallen en 31 (18,9%) contacten met bevestigde gevallen. Drieënnegentig (56,7%) deelnemers waren mannen en de gemiddelde (± SD) leeftijd van de deelnemers was 31,10 (± 11,82) jaar.
In deze studie werden de positieve en negatieve percentages van vier COVID-19-testen bepaald. Zo bedroegen de positieve percentages van de Abbott SARS-CoV-2-test, de Daan Gene 2019-nCoV-test, de SARS-CoV-2 BGI-test en de Sansure Biotech 2019-nCoV-test respectievelijk 59,1%, 58,5%, 57,9% en 55,5%. De positieve en negatieve samengestelde referentiestandaard (CRS)-scores waren respectievelijk 97 (59,1%) en 67 (40,9%) (tabel 1). In deze studie was de definitie van CRS gebaseerd op de regel "elk positief", waarbij van de vier testresultaten twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat opleverden, als echt positief of negatief werden beschouwd.
In deze studie vonden we een negatieve percentageovereenkomst (NPA) van 100% (95% BI 94,6-100) voor alle analyses vergeleken met CRS. De analyse van Sansure Biotechnology toonde een minimale PPA van 93,8% (95% BI 87,2-97,1) en de Daan Gene 2019-nCoV-analyse had een algehele overeenkomst van 99,4% (95% BI 96,6-99,9). Daarentegen was de algehele overeenkomst tussen de SARS-CoV-2 BGI-test en de Sansure Biotech 2019-nCoV-test respectievelijk 98,8% en 96,3% (tabel 2).
De kappacoëfficiënt van Cohen tussen CRS en de resultaten van de Abbott SARS-CoV-2-test was volledig consistent (K = 1,00). Ook de kappawaarden van Cohen, gedetecteerd door Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI en Sansure Biotech 2019-nCoV, zijn volledig consistent met CRS (K ≥ 0,925). In deze vergelijkende analyse toonde de chikwadraattoets (McNemar-toets) aan dat de resultaten van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test significant verschilden van de CRS-resultaten (p = 0,031) (tabel 2).
Zoals weergegeven in Fig.1 het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (gecombineerd RdRp- en N-gen) bedroeg 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toonde aan dat het percentage van de lage Ct-waarde (< 20 Ct) 50,3% bedroeg en de hoge Ct-waarde (36–40 Ct) 3,2%. 1 het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (gecombineerd RdRp- en N-gen) bedroeg 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toonde aan dat het percentage van de lage Ct-waarde (< 20 Ct) 50,3% bedroeg en de hoge Ct-waarde (36–40 Ct) 3,2%.Zoals weergegeven in Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, een Ct-waarde van ORF1a/b van Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) 50,3%, en een gemiddeld Ct (36-40 Ct) составляло 3,2%. 1, het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) analyse van Abbott SARS-CoV-2 (gecombineerde genen RdRp en N) was 87,6%, en de Ct-waarde van ORF1a/b-genanalyse van Sansure Biotech 2019-nCoV toonde aan dat het percentage lage Ct-waarde (< 20 Ct) goed was voor 50,3%, en hoge Ct-waarde (36–40 Ct) goed was voor 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) 3,2% van de kosten. Zoals weergegeven in Figuur 1, bedraagt ​​het laagste Ct-waardepercentage (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (combinatie van RdRp en N-gen) 87,6%, de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test vertoont een laag Ct-waardepercentage (< 20 Ct) van 50,3% en het lage Ct-waardepercentage (36–40 Ct) van 3,2%. Als het gaat om 1 jaar geleden, heeft Abbott SARS-CoV-2 (met RdRp en N) een andere kans значение Ct (< 20 Ct) op 87,6%, een значение Ct гена ORF1a/b in исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Zoals weergegeven in figuur 1 had de Abbott SARS-CoV-2-test (een combinatie van de RdRp- en N-genen) de laagste percentage Ct-waarde (< 20 Ct) met 87,6%, terwijl de Ct-waarde van het ORF1a/b-gen in de Sansure Biotech 2019-studie – De analyse van nCoV een lage Ct liet zien. De prijs van een aandeel (< 20 Ct) bedraagt ​​50,3%, en een aandeel van Ct (36–40 Ct) bedraagt ​​3,2%. Het percentage waarden (< 20 Ct) bedroeg 50,3%, en het percentage hoge Ct-waarden (36–40 Ct) bedroeg 3,2%.De Abbott SARS-CoV-2 B-test registreerde Ct-waarden boven de 30. Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen in de BGI SARS-CoV-2-test een hoge Ct-waarde (> 36 Ct), het percentage was 4% (Fig. 1). Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen in de BGI SARS-CoV-2-test een hoge Ct-waarde (> 36 Ct), het percentage was 4% (Fig. 1). Als u een BGI SARS-CoV-2 met ORF1a/b met een Ct-waarde (> 36 Ct) heeft, wordt deze aanbevolen составлял 4% (рис. 1). Bij de analyse van BGI SARS-CoV-2 werd daarentegen een hoge Ct-waarde voor het gen ORF1a/b gevonden (> 36 Ct), waarvan het percentage 4% bedroeg (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Daarentegen bedraagt ​​bij BGI SARS-CoV-2-detectie het percentage ORF1a/b-genen met een hoge Ct-waarde (>36 Ct) 4% (Figuur 1). Met een BGI SARS-CoV-2-apparaat voor ORF1a/b met een Ct-waarde (>36 Ct) 4% (рис. 1). Daarentegen bedroeg in de BGI SARS-CoV-2-analyse het percentage ORF1a/b-genen met hoge Ct-waarden (>36 Ct) 4% (Fig. 1).
In deze studie hebben we 164 neuskeelholtemonsters genomen. Voor alle soorten assays werd RNA-isolatie en -amplificatie uitgevoerd met behulp van de methoden en kits die door de betreffende fabrikanten worden aanbevolen.
Deze studie toonde aan dat Abbott's test voor SARS-CoV-2 dezelfde detectieprestaties levert als CRS, met 100% positieve, negatieve en algehele concordantie. Cohen's kappa-overeenkomst is 1,00, wat duidt op volledige overeenstemming met CRS. Een vergelijkbare studie van de Universiteit van Washington in de VS toonde aan dat de algehele gevoeligheid en specificiteit van de Abbott-test voor SARS-CoV-2 respectievelijk 93% en 100% bedroegen, vergeleken met de laboratoriumbepaalde test (LDA) van de CDC. 11. Het Abbott SARS-CoV-2-detectiesysteem is gebaseerd op de gelijktijdige gecombineerde detectie van de N- en RdRp-genen, aangezien beide genen gevoeliger zijn, waardoor vals-negatieven worden geminimaliseerd12. Een studie in Wenen, Oostenrijk, toonde ook aan dat grote extractiemonstervolumes en detectie-eluensvolumes de verdunningseffecten minimaliseerden en de detectie-efficiëntie verhoogden13. Zo kan de perfecte match van Abbott voor de SARS-CoV-2-test worden gekoppeld aan een platformdetectiesysteem dat gelijktijdig combinatorische genen detecteert, een groot aantal monsters (0,5 ml) extraheert en een grote hoeveelheid eluens (40 µl) gebruikt.
Onze resultaten toonden ook aan dat de detectieprestaties van de Daan-genetische test vrijwel gelijk waren aan die van CRS. Dit komt overeen met een onderzoek14 uitgevoerd aan de Anhui Universiteit in Huainan, China, en de bewering van de fabrikant dat er sprake is van 100% positieve overeenstemming. Ondanks rapporten van consistente resultaten, was één monster vals-negatief na hertesten van hetzelfde eluaat, maar positief in de Abbott SARS-CoV-2 en Sansure Biotech nCoV-2019 assays. Dit suggereert dat er mogelijk variatie in de resultaten is tussen verschillende soorten assays. Niettemin was de uitkomst van de Daan Gene-test in het onderzoek dat in China15 werd uitgevoerd, significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met de in het laboratorium gedefinieerde referentietest. Niettemin was de uitkomst van de Daan Gene-test in het onderzoek dat in China15 werd uitgevoerd, significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met de in het laboratorium gedefinieerde referentietest. Ik weet niet wat, in de wereld, in Китае15, van Daan Gene отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного analasiza. In een onderzoek in China15 verschilde de analyse van Daan Gene echter aanzienlijk (p < 0,05) van de laboratoriumreferentieanalyse.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Als u zich in de wereld van Китае15 bevindt, kunt u meer informatie krijgen over Daan отличались (p < 0,05) по сравнению с его Het is mogelijk om de temperatuur te verlagen. In een onderzoek in China15 waren de resultaten van Daan's genetische test echter significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met de referentielaboratoriumtest.Deze discrepantie kan te wijten zijn aan de gevoeligheid van de referentietest voor het detecteren van SARS-CoV-2. Verder onderzoek kan belangrijk zijn om de oorzaak hiervan te achterhalen.
Bovendien evalueerde onze studie de vergelijkende prestaties van de SARS-CoV-2 BGI-test met CRS, met een uitstekende positieve percentageovereenkomst (PPA = 97,9%), negatieve percentageovereenkomst (NPA = 100%) en algehele percentageovereenkomst per geslacht (OPA). = 98,8%). Cohen's Kappa-waarden lieten een goede overeenkomst zien (K = 0,975). Studies in Nederland16 en China15 hebben consistente resultaten laten zien. De SARS-CoV-2 BGI-test is een detectietest voor één enkel gen (ORF1a/b) met behulp van 10 µl amplificatie-/detectie-eluaat. Ondanks een goede statistische overeenkomst met onze referentieresultaten, miste de analyse twee positieve monsters (1,22%) van het totale monster. Dit kan enorme klinische implicaties hebben voor de transmissiedynamiek op zowel patiënt- als gemeenschapsniveau.
Een andere vergelijkende analyse in deze studie was de Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-test; het totale percentage overeenkomsten was 96,3%. De mate van overeenstemming werd ook bepaald door de Cohen's Kappa-waarde, die 0,925 bedroeg, wat wijst op volledige overeenstemming met de CRS. Ook hier zijn onze resultaten identiek aan die van studies uitgevoerd aan de Central South University in Changsha, China, en aan de afdeling Klinisch Laboratorium van het Liuzhou People's Hospital in Liuzhou, China17. Hoewel de bovenstaande goede statistische concordantie werd vastgesteld, toonde de chi-kwadraattoets (MacNemar-toets) aan dat de uitkomst van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde vergeleken met CRS (p < 0,005). Hoewel de bovenstaande goede statistische concordantie werd vastgesteld, toonde de chi-kwadraattoets (MacNemar-toets) aan dat de uitkomst van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde vergeleken met CRS (p < 0,005). Als u dit wilt, kunt u de beste resultaten behalen, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) Als u dit wilt doen, is Sansure Biotech een bedrijf dat CRS (p < 0,005). Hoewel de bovenstaande goede statistische overeenkomst werd vastgelegd, toonde de chi-kwadraattoets (McNemar-toets) aan dat de uitkomst van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde vergeleken met de CRS (p < 0,005).CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。Sansure Biotech CRS Als u een probleem met het gebruik van een kredietkaart wilt, kunt u dit doen Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech en CRS. Ondanks de goede statistische overeenkomst die hierboven is opgemerkt, toonde de chi-kwadraattoets (McNemar-toets) een statistisch significant verschil (p < 0,005) tussen de Sansure Biotech-test en de CRS.Zes monsters (3,66%) bleken vals-negatief in vergelijking met CRS (aanvullende tabel 1); dit is zeer belangrijk, vooral gezien de dynamiek van de virusoverdracht. Bovenstaande gegevens ondersteunen ook dit lage detectiepercentage15.
In deze studie werden Ct-waarden bepaald voor elke assay en het bijbehorende platform, met de laagste gemiddelde Ct-waarde gerapporteerd in de Abbott SARS-CoV-2-assay. Dit resultaat kan verband houden met Abbotts gelijktijdig gecombineerde genetische testsysteem voor de detectie van SARS-CoV-2. Volgens figuur 1 had 87,6% van de Abbott SARS-CoV-2-resultaten Ct-waarden lager dan 20. Slechts een klein aantal monsterresultaten (12,4%) bevond zich in het bereik van 20-30. Ct-waarden boven de 30 werden niet geregistreerd. Naast Abbotts gebruik van het SARS-CoV-2 panel genetische testformat, kan dit resultaat verband houden met de onderste detectielimiet (32,5 RNA-kopieën/ml)18, die drie keer lager is dan de ondergrens van het bedrijf van 100 RNA-kopieën/ml. (ml)19.
Deze studie kent enkele beperkingen: ten eerste beschikken we niet over standaard-/referentiemethoden [zoals viral load of andere laboratoriumtests (LDA)] vanwege een gebrek aan middelen. Ten tweede waren alle in deze studie gebruikte monsters neusslijmvliesuitstrijkjes, terwijl de resultaten niet van toepassing waren op andere soorten monsters, en ten derde was onze steekproefomvang klein.
In deze studie werden de prestaties van vier rRT-PCR-tests voor SARS-CoV-2 met behulp van nasofaryngeale monsters vergeleken. Alle detectietests hadden vrijwel vergelijkbare prestaties, met uitzondering van de Sansure Biotech-test. Bovendien werd in de Sansure Biotech-test een laag positief percentage vastgesteld vergeleken met de CRS (p < 0,05). Bovendien werd in de Sansure Biotech-test een laag positief percentage vastgesteld vergeleken met de CRS (p < 0,05). Als u van plan bent Sansure Biotech te helpen uw bedrijf te redden с CRS (p < 0,05). Bovendien liet de test van Sansure Biotech een laag percentage positieve resultaten zien vergeleken met CRS (p < 0,05).此外，CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Wat Sansure Biotech betreft, is het mogelijk om een ​​​​goedkoop product te kopen CRS (p < 0,05). Bovendien had de Sansure Biotech-test een lagere positiefheidsgraad vergeleken met CRS (p < 0,05).De Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analyse van PPA, NPA en algehele overeenstemming overtrof de 93,5% met een Cohen Kappa-waarde van 0,925. Ten slotte moet de Sansure Biotech Assay (RUO) verder worden gevalideerd voor gebruik in Ethiopië en moet aanvullend onderzoek worden overwogen om claims van individuele fabrikanten te evalueren.
Het vergelijkende onderzoeksontwerp werd uitgevoerd in vier zorginstellingen in Addis Abeba: het Eka Kotebe Ziekenhuis, het Millennium Church Treatment Centre, het Zewooditu Memorial Ziekenhuis en het St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. De gegevens werden verzameld tussen 1 en 31 december 2020. De medische instellingen voor deze studie werden doelbewust gekozen op basis van hun hoge aantal gevallen en de beschikbaarheid van belangrijke behandelcentra in de stad. Instrumenten, waaronder de ABI 7500 en Abbott m2000 real-time PCR-instrumenten, werden eveneens geselecteerd volgens de aanbevelingen van de NAAT-reagentiafabrikanten. Voor deze studie werden vier PCR-detectiekits geselecteerd, aangezien de meeste laboratoria in Ethiopië er minstens vier gebruikten. De gentest, de Abbott SARS-CoV-2-test, de Sansure Biotech-test en de SARS-CoV-2 BGI-test werden tijdens de studie uitgevoerd.
De tests op SARS-CoV-2 werden uitgevoerd van 1 tot en met 30 december 2020 met behulp van 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) van personen die werden onderzocht op COVID-19 en die naar EPHI waren doorverwezen. Nasofaryngeale monsters werden verzameld door getrainde monsterverzamelaars en in drievoudige verpakkingen naar EPHI verzonden. Voorafgaand aan de isolatie van nucleïnezuur krijgt elk monster een uniek identificatienummer. Extractie wordt direct na ontvangst uit elk monster uitgevoerd met behulp van handmatige en automatische extractiemethoden. Zo werd voor de automatische extractie van Abbott m2000 1,3 ml (inclusief 0,8 ml dood volume en 0,5 ml extractie-inlaatvolume) van het monster uit elk monster geëxtraheerd en door het Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, VS) geleid. ) Een batch van 96 [92 monsters, twee detectiecontroles en twee niet-templatecontroles (NTC)] werd opgenomen in het totale proces (ophalen en detecteren) van twee ronden SARS-CoV-2 (EUA) in realtime. mining. Gebruik voor handmatige extractie dezelfde monsters (voor automatische extractie en detectie). Gedurende het proces werden monsters van 140 µl gealiquoteerd en geëxtraheerd met behulp van de QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland) in batches van 24 (inclusief 20 monsters, twee assaycontroles en twee NTC's) gedurende negen ronden. Handmatig geëxtraheerde eluaten werden geamplificeerd en gedetecteerd met een ABI 7500 thermocycler met behulp van de SARS-CoV-2 BGI-assay, de Daan Gene-assay en de Sansure Biotech-assay.
Geautomatiseerde isolatie en zuivering van viraal RNA van SARS-CoV-2 volgt het principe van magnetische kralen met behulp van Abbott DNA-monsterbereidingsreagentia. Inactivering van monsters en solubilisatie van virusdeeltjes wordt uitgevoerd met een detergent dat guanidine-isothiocyanaat bevat om het eiwit te denatureren en RNase te inactiveren. Het RNA wordt vervolgens van het eiwit gescheiden door vastefasescheiding met silica, d.w.z. het guanidiniumzout en de alkalische pH van de lysisbuffer bevorderen de binding van de nucleïnezuren aan het silica (SiO2). De spoelstap verwijdert resterende eiwitten en vuil om een ​​heldere oplossing te produceren. Transparant RNA wordt geïsoleerd uit microdeeltjes op silicabasis met behulp van het magnetische veld van het instrument20,21. Handmatige isolatie en zuivering van RNA daarentegen wordt uitgevoerd met de spinkolommethode, waarbij gebruik wordt gemaakt van centrifugatie in plaats van een magnetische standaard en scheiding van microdeeltjes van het eluens.
De Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, die EUA19,22 ontving van de WHO en FDA. In dit protocol werd de monsterinactivatie vóór extractie uitgevoerd in een waterbad bij 56 °C gedurende 30 minuten. Na virusinactivatie werd nucleïnezuurextractie uitgevoerd met een Abbott m2000 SP-instrument van 0,5 ml VTM met behulp van een Abbott m2000 DNA-monsterbereidingssysteem, volgens de fabrikant. Amplificatie en detectie werden uitgevoerd met een Abbott m2000 RT-PCR-instrument, en dubbele detectie werd uitgevoerd voor de RdRp- en N-genen. ROX) en VIC P (gepatenteerde kleurstof) voor targeting en detectie van interne controles, waardoor gelijktijdige detectie van beide amplificatieproducten mogelijk is 19 .
De amplificatiedetectiemethode van deze kit is gebaseerd op éénstaps RT-PCR-technologie. De ORF1a/b- en N-genen werden door Daan Gene Technology geselecteerd als geconserveerde regio's om amplificatie van doelregio's te detecteren. Specifieke primers en fluorescerende probes (N-genprobes gelabeld met FAM, ORF1a/b-probes gelabeld met VIC) zijn ontworpen om SARS-CoV-2 RNA in monsters te detecteren. Het uiteindelijke eluens en de mastermix werden bereid door 5 µl eluens toe te voegen aan 20 µl van de mastermix tot een eindvolume van 25 µl. Amplificatie en detectie werden gelijktijdig uitgevoerd op een ABI 750024 realtime PCR-instrument.
De ORF1a/b- en N-genen werden gedetecteerd met behulp van de Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescentie-PCR-detectie). Bereid specifieke probes voor elk doelgen voor door het FAM-kanaal voor de ORF1a/b-regio en het ROX-kanaal voor het N-gen te selecteren. Aan deze assaykit worden eluens en mastermixreagentia als volgt toegevoegd: bereid 30 µl mastermixreagens en 20 µl geëlueerd monster voor detectie/amplificatie. Real-time PCR ABI 750025 werd gebruikt voor amplificatie/detectie.
De SARS-CoV-2 BGI-test is een fluorescerende realtime rRT-PCR-kit voor de diagnose van COVID-19. De doelregio bevindt zich in de ORF1a/b-regio van het SARS-CoV-2-genoom, een detectiemethode voor één enkel gen. Daarnaast is het humane housekeeping-gen β-actine een intern gereguleerd doelgen. De mastermix wordt bereid door 20 µl van het mastermix-reagens en 10 µl van het geëxtraheerde RNA-monster in een wellplaat te mengen26. Een ABI 7500 fluorescerend kwantitatief realtime PCR-instrument werd gebruikt voor de amplificatie en detectie. Alle nucleïnezuuramplificatie, PCR-runcondities voor elke assay en interpretatie van de resultaten werden uitgevoerd volgens de instructies van de betreffende fabrikant (tabel 3).
In deze vergelijkende analyse hebben we de referentiestandaardmethode niet gebruikt om het percentage overeenstemming (positief, negatief en algeheel) en andere vergelijkingsparameters voor de vier analyses te bepalen. Elke testvergelijking werd uitgevoerd met CRS; in deze studie werd de CRS ingesteld op basis van de regel "elk positief" en werd het resultaat bepaald, niet door één enkele test; we gebruikten ten minste twee overeenkomende testresultaten. Bovendien zijn in het geval van COVID-19-overdracht vals-negatieve resultaten gevaarlijker dan vals-positieve resultaten. Om daarom zo nauwkeurig mogelijk "positief" te kunnen zeggen op basis van een CRS-resultaat, moeten ten minste twee assaytests positief zijn. Dit betekent dat ten minste één positief resultaat waarschijnlijk afkomstig is van een EUA-assay. Van de vier testresultaten worden dus twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat opleveren, als echt positief of negatief beschouwd18,27.
Gegevens werden verzameld met behulp van gestructureerde data-extractieformulieren, en gegevensinvoer en -analyse werden uitgevoerd met behulp van Excel, de statistische software, en SPSS versie 23.0 voor beschrijvende statistieken. Positieve, negatieve en algehele procentuele overeenstemming werden geanalyseerd, en een Kappa-score werd gebruikt om de mate van overeenstemming van elke methode met CRS te bepalen. Kappa-waarden worden als volgt geïnterpreteerd: 0,01 tot 0,20 voor milde overeenstemming, 0,21 tot 0,40 voor algemene overeenstemming, 0,41-0,60 voor matige overeenstemming, 0,61-0,80 voor grote overeenstemming en 0,81-0,99 voor volledige overeenstemming28.
Ethische goedkeuring werd verkregen van de Universiteit van Addis Abeba en alle experimentele protocollen voor deze studie werden goedgekeurd door de Scientific Ethics Review Board van het Ethiopische Instituut voor Volksgezondheid. Het referentienummer voor de EPHI Ethics License is EPHI/IRB-279-2020. Alle methoden werden toegepast in overeenstemming met de aanbevelingen en bepalingen van de Ethiopische Nationale Uitgebreide Richtlijnen voor de Behandeling van COVID-19. Daarnaast werd voorafgaand aan deelname aan de studie schriftelijke, geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers.
Alle in dit onderzoek verkregen of geanalyseerde gegevens zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel. Gegevens die de resultaten van dit onderzoek ondersteunen, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de betreffende auteur.
Wereldgezondheidsorganisatie. Aanbevelingen voor laboratoriumteststrategieën voor COVID-19: Interim Guidance, 21 maart 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Slimme diagnose van COVID-19 op de spoedeisende hulp: all-in in de praktijk. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Slimme diagnose van COVID-19 op de spoedeisende hulp: all-in in de praktijk.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. en Gurgulianis, KI Intelligente diagnose van COVID-19 op de spoedeisende hulp: alles in de praktijk.Muliou DS, Pantazopoulos I. en Gurgulyanis KI Intelligente diagnose van COVID-19 op spoedeisende hulp: end-to-end integratie in de praktijk. Expert Reverend Respire. geneeskunde. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test. Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell, SL en St. George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell SL en St. George K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriumdetectie van coronavirusziekte 2019 (COVID-19) bij vermoedelijke menselijke ziekte. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (geraadpleegd op 15 augustus 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnose: ziekten en testinstrumenten. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Oprichting van het College van Pathologen van Oost-, Centraal- en Zuidelijk Afrika – Regionale School voor Pathologie van het Midden-Oosten en Zuid-Afrika. Africa. J. Lab. geneeskunde. 9(1), 1-8 (2020).
Ethiopisch Instituut voor Volksgezondheid, Federaal Ministerie van Volksgezondheid. Interim Nationale Strategie en Richtlijnen voor Laboratoriumdiagnostiek van COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (geraadpleegd op 12 augustus 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Vals-negatieve tests voor de uitdagingen en implicaties van SARS-CoV-2-infectie. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Vals-negatieve tests voor de uitdagingen en implicaties van SARS-CoV-2-infectie.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor SARS-CoV-2-infecties en de gevolgen daarvan.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor provocatie en de impact van SARS-CoV-2-infectie. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS en Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve COVID-19-gevallen: preventie- en behandelingsstrategieën voor de luchtwegen, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS en Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve COVID-19-gevallen: preventie- en behandelingsstrategieën voor de luchtwegen, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI COVID-19: респираторная профилактика en стратегии лечения, вакцинация en Controleer de werking. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve gevallen van COVID-19: preventie- en behandelingsstrategieën voor de ademhaling, vaccinatie en de weg vooruit.Muliu, DS en Gurgulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve gevallen van COVID-19: strategieën voor respiratoire preventie en behandeling, vaccinatie en de weg vooruit. Expert Reverend Respire. geneeskunde. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de spoedeisende hulp: de boom zien, maar het bos verliezen. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de spoedeisende hulp: de boom zien, maar het bos verliezen.Mouliou, DS, Ioannis, P. en Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de spoedeisende hulp: zie de boom, verlies het bos.Muliou DS, Ioannis P. en Konstantinos G. COVID-19-diagnose op de spoedeisende hulp: te weinig bos door de bomen. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validatie en validatie van de analytische en klinische prestaties van de Abbott RealTime SARS-CoV-2-test. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. en Aflatunyan, B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. COVID-19 RT-PCR-technologie is geschikt voor het gebruik van RT-PCR-technologie. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van 5 verschillende genetische regio's van COVID-19 voor de detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. en Aflatunyan B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Iran. J. Microbiologie. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Voorlopige resultaten van het nationale externe kwaliteitsbeoordelingsprogramma voor de detectie van SARS-CoV-2-genoomsequenties. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytische evaluatie van de werkzaamheid van vijf RT-PCR-kits voor ernstig acuut respiratoir syndroom Coronavirus 2. J. Klinisch. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluatie van zeven commercieel verkrijgbare SARS-CoV-2 RNA-detectiekits in China op basis van real-time polymerasekettingreactie (PCR). klinisch. chemisch. laboratorium. geneeskunde. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Vergelijking van zeven commerciële RT-PCR COVID-19 diagnostische kits. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Vergelijking van de diagnostische prestaties van twee PCR-kits voor de detectie van SARS-CoV-2-nucleïnezuren. J. Klinisch. laboratorium. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, enz. Een vergelijkende studie van vier SARS-CoV-2-platforms voor nucleïnezuuramplificatietests (NAAT) toonde aan dat de ID NOW-prestaties aanzienlijk verslechterden, afhankelijk van de patiënt en het type monster. diagnose. microbiologie. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott-molecuul. Abbott realtime SARS-CoV-2-analyse bijsluiter. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Per 10 augustus 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolatie met behulp van magnetische kralen voor snelle grootschalige detectie door middel van RT-qPCR en RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).