Uitvoering van vier nucleïnezuuramplificatietests om SARS-CoV-2 in Ethiopië te identificeren

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Sinds de uitbraak van de coronavirusziekte (COVID-19) in 2019 zijn er over de hele wereld veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT’s) ontwikkeld die standaardtests zijn geworden. Hoewel er snel verschillende tests werden ontwikkeld en toegepast op diagnostische laboratoriumtests, is de prestatie van deze tests niet in verschillende omgevingen geëvalueerd. Daarom was dit onderzoek bedoeld om de prestaties van de Abbott SARS-CoV-2-, Daan Gene-, BGI- en Sansure Biotech-assays te evalueren met behulp van de Composite Reference Standard (CRS). Het onderzoek werd van 1 tot 30 december 2020 uitgevoerd bij het Ethiopische Public Health Institute (EPHI). Er werden 164 nasofaryngeale monsters geëxtraheerd met behulp van de QIAamp RNA-minikit en het Abbott DNA-monstervoorbereidingssysteem. Van de 164 monsters was 59,1% positief en 40,9% negatief voor CRS. De positiviteit van Sansure Biotech was significant laag vergeleken met CRS (p < 0,05). De positiviteit van Sansure Biotech was significant laag vergeleken met CRS (p < 0,05). De resultaten van Sansure Biotech zijn niet geschikt voor CRS (p < 0,05). De positieve resultaten van Sansure Biotech waren aanzienlijk lager vergeleken met CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）。 Sansure Biotech heeft een positief effect op het CRS-niveau (p < 0,05). Sansure Biotech had significant minder positieve resultaten vergeleken met CRS (p < 0,05).De algehele overeenstemming van de vier analyses was 96,3–100% vergeleken met CRS. Naast het lage positiviteitspercentage van de Sansure Biotech-test waren de prestaties van de vier testen vrijwel vergelijkbaar. Als zodanig vereist de Sansure Biotech [Research Only (RUO)]-test aanvullende validatie voor gebruik in Ethiopië. Ten slotte moet aanvullend onderzoek worden overwogen om testen met de juiste claims van de fabrikant te evalueren.
Laboratoriumtests maken deel uit van het Strategisch Plan voor de Ziekte van het Coronavirus 2019 (COVID-19) Preparedness and Response (SPRP) van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). De WHO adviseert dat landen laboratoriumcapaciteit moeten opbouwen om de paraatheid, het juiste casemanagement, de waakzaamheid en de snelle reactie op uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid te verbeteren. Dit suggereert dat de rol van het laboratorium van cruciaal belang is voor het karakteriseren van de ziekte en de epidemiologie van opkomende infectieuze agentia en het beheersen van de verspreiding ervan.
De diagnose van COVID-19 vereist epidemiologische en medische informatie, persoonlijke symptomen/tekenen, en radiografische en laboratoriumgegevens2. Sinds de uitbraak van COVID-19 in Wuhan, China, zijn er over de hele wereld veel commerciële nucleïnezuuramplificatietests (NAAT’s) ontwikkeld. Realtime reverse transcriptiepolymerasekettingreactie (rRT-PCR) is gebruikt als routinematige en standaardmethode voor laboratoriumdiagnostiek van ernstige acute respiratoire syndroom 2 (SARS-CoV-2)3-infectie. Moleculaire detectie van SARS-CoV-2 is doorgaans gebaseerd op de N (nucleocapside-eiwitgen), E (envelopeiwitgen) en RdRp (RNA-afhankelijk RNA-polymerasegen) genen in ORF1a/b (open leesraam 1a/b) . gen) regio geïdentificeerd uit het virale genoom. Ze worden beschouwd als de belangrijkste geconserveerde regio’s die in virale genomen worden aangetroffen voor virusherkenning4. Van deze genen hebben de RdRp- en E-genen een hoge analytische detectiegevoeligheid, terwijl het N-gen een lage analytische gevoeligheid heeft5.
De prestaties van PCR-testen kunnen variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals: extractiereagentia, amplificatie-/detectiereagentia, extractiemethode, kwaliteit van de PCR-machine en andere instrumenten. Sinds april 2020 hebben meer dan 48 verschillende diagnostische apparaten uit negen landen een Emergency Use Authorization (EUA) ontvangen voor COVID-196-diagnostiek. In Ethiopië worden meer dan 14 real-time PCR-platforms gebruikt voor PCR-detectie van SARS-CoV-2 bij 26 volksgezondheidsinstellingen, waaronder ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 en Quant-studio7. Daarnaast zijn er verschillende PCR-testkits beschikbaar, zoals de Daan Gene-test, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test en SARS-CoV-2 BGI-test. Hoewel rRT-PCR zeer gevoelig is, rapporteren sommige patiënten met COVID-19 vals-negatieve resultaten als gevolg van onvoldoende kopieën van viraal ribonucleïnezuur (RNA) in monsters als gevolg van onjuiste verzameling, transport, opslag en behandeling, en laboratoriumtests. omstandigheden en handelingen van het personeel8. Bovendien kunnen verkeerd gebruik van monsters of controles, instelling van de cyclusdrempel (Ct) en kruisreactiviteit met andere pathogene nucleïnezuren of inactief/resterend SARS-CoV-2-RNA leiden tot vals-positieve resultaten in rRT-PCR9-tests. Het is dus duidelijk dat PCR-tests inderdaad dragers van genfragmenten kunnen identificeren, omdat ze niet eens onderscheid kunnen maken tussen werkelijk actieve virale genen, zodat de tests alleen dragers kunnen identificeren en niet patiënten10. Daarom is het belangrijk om de diagnostische prestaties te beoordelen met behulp van standaardmethoden in onze setting. Hoewel er veel NAAT-reagentia verkrijgbaar zijn bij het Ethiopische Volksgezondheidsinstituut (EPHI) en in het hele land, is er nog geen vergelijkende evaluatie van hun effectiviteit gerapporteerd. Daarom was deze studie gericht op het evalueren van de vergelijkende prestaties van in de handel verkrijgbare kits voor de detectie van SARS-CoV-2 door rRT-PCR met behulp van klinische monsters.
In totaal zijn 164 deelnemers met vermoedelijke COVID-19 in dit onderzoek betrokken. Het merendeel van de monsters kwam uit behandelcentra (118/164 = 72%), terwijl de overige 46 (28%) deelnemers afkomstig waren uit niet-behandelcentra. Van de deelnemers die niet in het centrum werden behandeld, hadden 15 (9,1%) klinisch verdachte gevallen en 31 (18,9%) contacten met bevestigde gevallen. Drieënnegentig (56,7%) deelnemers waren mannen en de gemiddelde (± SD) leeftijd van de deelnemers was 31,10 (± 11,82) jaar.
In dit onderzoek werden de positieve en negatieve percentages van vier tests voor COVID-19 bepaald. De positieve percentages van de Abbott SARS-CoV-2-test, Daan Gene 2019-nCoV-test, SARS-CoV-2 BGI-test en Sansure Biotech 2019-nCoV-test waren respectievelijk 59,1%, 58,5%, 57,9% en 55,5%. . De positieve en negatieve samengestelde referentiestandaardscores (CRS) waren respectievelijk 97 (59,1%) en 67 (40,9%) (Tabel 1). In dit onderzoek was de definitie van CRS gebaseerd op de regel ‘elk positief’, waarbij van de vier testresultaten twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat opleverden, als echt positief of negatief werden beschouwd.
In deze studie vonden we een negatieve procentuele overeenstemming (NPA) van 100% (95% BI 94,6–100) voor alle analyses vergeleken met CRS. De Sansure Biotechnology-analyse toonde een minimale PPA van 93,8% (95% BI 87,2-97,1) en de Daan Gene 2019-nCoV-analyse had een algehele overeenstemming van 99,4% (95% BI 96,6-99,9). Daarentegen was de algemene overeenstemming tussen de SARS-CoV-2 BGI-test en de Sansure Biotech 2019-nCoV-test respectievelijk 98,8% en 96,3% (Tabel 2).
De Cohen's Kappa-overeenstemmingscoëfficiënt tussen de resultaten van de CRS en de Abbott SARS-CoV-2-test was volledig consistent (K = 1,00). Op dezelfde manier zijn de Cohen’s kappa-waarden gedetecteerd door Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI en Sansure Biotech 2019-nCoV ook volledig consistent met CRS (K ≥ 0,925). In deze vergelijkende analyse bleek uit de chikwadraattest (McNemar-test) dat de resultaten van de Sansure Biotech 2019-nCoV-assay significant verschilden van de CRS-resultaten (p = 0,031) (Tabel 2).
Zoals weergegeven in afb.1 Het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (gecombineerd RdRp- en N-gen) was 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toonde aan dat het percentage lage De Ct-waarde (< 20 Ct) was 50,3% en de hoge Ct-waarde (36–40 Ct) was 3,2%. 1 Het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (gecombineerd RdRp- en N-gen) was 87,6% en de ORF1a/b-gen-Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toonde aan dat het percentage lage De Ct-waarde (< 20 Ct) was 50,3% en de hoge Ct-waarde (36–40 Ct) was 3,2%.Zoals weergegeven in afb.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, een Ct-waarde van ORF1a/b van Sansure Biotech 2019-nCoV-waarde van de Ct-waarde (< 20 Ct) 50,3%, een gemiddelde Ct (36-40 Ct) 3,2%. 1 was het percentage van de laagste Ct-waarde (< 20 Ct)-analyse van Abbott SARS-CoV-2 (gecombineerde gen RdRp en N) 87,6%, en de Ct-waarde van ORF1a/b-genanalyse van Sansure Biotech 2019-nCoV toonde dat het percentage lage Ct-waarde (<20 Ct) verantwoordelijk was voor 50,3%, en hoge Ct-waarde (36-40 Ct) was goed voor 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87,6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%,高Ct 值(36–40 Ct) 3,2% van de kosten. Zoals weergegeven in Figuur 1 is het laagste Ct-waardepercentage (< 20 Ct) van de Abbott SARS-CoV-2-test (combinatie van RdRp en N-gen) 87,6%, de ORF1a/b-gen Ct-waarde van de Sansure Biotech 2019-nCoV-test toont een lage Ct值(< 20 Ct) 的 percentage is 50,3%, 高Ct值(36–40 Ct) 的 percentage is 3,2%. Als het gaat om 1 jaar geleden, heeft Abbott SARS-CoV-2 (met RdRp en N) een andere kans Ct (< 20 Ct) op 87,6%, een Ct met ORF1a/b in Sansure Biotech 2019-Анализ nCoV показал низкий Ct. Zoals weergegeven in Figuur 1 had de Abbott SARS-CoV-2-test (die de RdRp- en N-genen combineert) de laagste procentuele Ct-waarde (< 20 Ct) van 87,6%, terwijl de Ct-waarde van het ORF1a/b-gen in het Sansure-gen Biotech 2019-studie – De analyse van nCoV liet een lage Ct zien. De prijs van een aandeel (< 20 Ct) bedraagt ​​50,3%, en een aandeel van Ct (36–40 Ct) bedraagt ​​3,2%. Het percentage waarden (< 20 Ct) was 50,3% en het percentage hoge Ct-waarden (36–40 Ct) was 3,2%.De Abbott SARS-CoV-2 B-test registreerde Ct-waarden boven de 30. Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen bij de BGI SARS-CoV-2-test een hoge Ct-waarde (> 36 Ct). Het percentage was 4% (Fig. 1). Aan de andere kant had het ORF1a/b-gen bij de BGI SARS-CoV-2-test een hoge Ct-waarde (> 36 Ct). Het percentage was 4% (Fig. 1). Als u een BGI SARS-CoV-2 met ORF1a/b met een Ct-waarde (> 36 Ct) heeft, wordt deze aanbevolen составлял 4% (рис. 1). Aan de andere kant had het SARS-CoV-2-gen ORF1a/b in de analyse van BGI een hoge Ct-waarde (> 36 Ct), waarvan het percentage 4% was (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Aan de andere kant is bij BGI SARS-CoV-2-detectie het percentage ORF1a/b-gen met een hoge Ct-waarde (>36 Ct) 4% (Figuur 1). Met een BGI SARS-CoV-2-apparaat voor ORF1a/b met een Ct-waarde (>36 Ct) 4% (рис. 1). Aan de andere kant was in de BGI SARS-CoV-2-analyse het percentage ORF1a/b-genen met hoge Ct-waarden (>36 Ct) 4% (Fig. 1).
In deze studie hebben we 164 nasofaryngeale monsters genomen. Voor alle soorten tests werd RNA-isolatie en -amplificatie uitgevoerd met behulp van de methoden en kits die door de respectieve fabrikanten werden aanbevolen.
Deze studie toonde aan dat de test van Abbott voor SARS-CoV-2 dezelfde detectieprestaties heeft als CRS, met 100% positieve, negatieve en algemene overeenstemming. De kappa-overeenkomst van Cohen is 1,00, wat duidt op volledige overeenstemming met CRS. Uit een soortgelijk onderzoek van de Universiteit van Washington in de VS bleek dat de algehele gevoeligheid en specificiteit van de Abbott-test voor SARS-CoV-2 respectievelijk 93% en 100% bedroeg, vergeleken met de laboratoriumbepaling (LDA) van de CDC. . 11. Het Abbott SARS-CoV-2-detectiesysteem is gebaseerd op de gelijktijdige gecombineerde detectie van de N- en RdRp-genen, omdat beide genen gevoeliger zijn, waardoor valse negatieven worden geminimaliseerd12. Een onderzoek in Wenen, Oostenrijk toonde ook aan dat grote hoeveelheden extractiemonsters en volumes van detectie-eluenten de verdunningseffecten minimaliseerden en de detectie-efficiëntie verhoogden13. De perfecte match van Abbott voor de SARS-CoV-2-test kan dus worden geassocieerd met een platformdetectiesysteem dat tegelijkertijd combinatorische genen detecteert, een groot aantal monsters (0,5 ml) extraheert en een grote hoeveelheid eluens (40 µl) gebruikt.
Uit onze resultaten bleek ook dat de detectieprestaties van de genetische test van Daan vrijwel hetzelfde waren als die van CRS. Dit komt overeen met een onderzoek14 uitgevoerd aan de Anhui Universiteit in Huainan, China, en de claim van de fabrikant van 100% positieve overeenstemming. Ondanks rapporten van consistente resultaten was één monster vals-negatief na het opnieuw testen van hetzelfde eluaat, maar was het positief in de Abbott SARS-CoV-2 en Sansure Biotech nCoV-2019-tests. Dit suggereert dat er variatie kan zijn in de resultaten tussen verschillende soorten testen. Niettemin was in het onderzoek dat in China werd uitgevoerd15 het resultaat van de Daan Gene-test significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met hun in het laboratorium gedefinieerde referentietest. Niettemin was in het onderzoek dat in China werd uitgevoerd15 het resultaat van de Daan Gene-test significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met hun in het laboratorium gedefinieerde referentietest. Ik weet niet wat, in de wereld, in Китае15, van Daan Gene отличался (p < 0,05) of лабораторного эталонного анализа. In een onderzoek in China15 was het analyseresultaat van Daan Gene echter significant verschillend (p < 0,05) van hun laboratoriumreferentieanalyse.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Als u zich in de wereld van Китае15 bevindt, kunt u meer informatie krijgen over Daan отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. In een onderzoek in China15 waren de resultaten van de genetische test van Daan echter significant verschillend (p < 0,05) vergeleken met de referentielaboratoriumtest.Deze discrepantie kan te wijten zijn aan de gevoeligheid van de referentietest om SARS-CoV-2 te detecteren, en verder onderzoek kan belangrijk zijn om de oorzaak te achterhalen.
Daarnaast evalueerde ons onderzoek de vergelijkende prestaties van de SARS-CoV-2 BGI-test met CRS, waarbij uitstekende positieve procentuele overeenstemming (PPA = 97,9%), negatieve procentuele overeenstemming (NPA = 100%) en algehele procentuele overeenstemming per geslacht werden aangetoond ( OPA). ). = 98,8%). De Kappa-waarden van Cohen vertoonden een goede overeenkomst (K = 0,975). Studies in Nederland16 en China15 laten consistente resultaten zien. De SARS-CoV-2 BGI-test is een detectietest voor één gen (ORF1a/b) waarbij gebruik wordt gemaakt van 10 µl amplificatie/detectie-eluaat. Ondanks een goede statistische overeenkomst met onze referentieresultaten miste de analyse twee positieve monsters (1,22%) van het totale monster. Dit kan enorme klinische implicaties hebben voor de overdrachtsdynamiek op zowel patiënt- als gemeenschapsniveau.
Een andere vergelijkende analyse in dit onderzoek was de Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO)-test; het totale matchpercentage was 96,3%. De mate van overeenstemming werd ook bepaald door de Cohen's Kappa-waarde, die 0,925 bedroeg, wat duidt op volledige overeenstemming met de CRS. Nogmaals, onze resultaten zijn identiek aan onderzoeken uitgevoerd aan de Central South University in Changsha, China, en aan de klinische laboratoriumafdeling van het Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, China17. Hoewel de bovengenoemde goede statistische overeenstemming werd geregistreerd, toonde de chikwadraattest (MacNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde vergeleken met CRS (p < 0,005). Hoewel de bovengenoemde goede statistische overeenstemming werd geregistreerd, toonde de chikwadraattest (MacNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil vertoonde vergeleken met CRS (p < 0,005). Als u dit wilt, kunt u de beste resultaten behalen, критерий Sansure Biotech-producten van Sansure Biotech различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Hoewel de bovenstaande goede statistische overeenkomst werd geregistreerd, toonde de chikwadraattest (McNemar-test) aan dat het resultaat van de Sansure Biotech-test een statistisch significant verschil had vergeleken met de CRS (p < 0,005).CRS相比具有统计学显着差异（p < 0,005）。Sansure Biotech CRS Als u een probleem met het gebruik van een kredietkaart wilt, kunt u dit doen Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech en CRS. Ondanks de hierboven genoemde goede statistische overeenkomst vertoonde de chikwadraattest (McNemar-test) een statistisch significant verschil (p < 0,005) tussen de Sansure Biotech-test en de CRS.Zes monsters (3,66%) bleken vals-negatief te zijn vergeleken met CRS (aanvullende tabel 1); dit is erg belangrijk, vooral gezien de dynamiek van de overdracht van het virus. De bovenstaande gegevens ondersteunen ook dit lage detectiepercentage15.
In deze studie werden de Ct-waarden bepaald voor elke test en het betreffende platform, waarbij de laagste gemiddelde Ct-waarde werd gerapporteerd in de Abbott SARS-CoV-2-test. Dit resultaat kan verband houden met het gelijktijdige gecombineerde genetische testsysteem van Abbott voor de detectie van SARS-CoV-2. Daarom had volgens Figuur 1 87,6% van de Abbott SARS-CoV-2-resultaten Ct-waarden lager dan 20. Slechts een klein aantal monsterresultaten (12,4%) lag in het bereik van 20-30. Ct-waarden boven de 30 werden niet geregistreerd. Naast het gebruik door Abbott van het genetische testformaat van het SARS-CoV-2-panel, kan dit resultaat verband houden met de lagere detectielimiet (32,5 RNA-kopieën/ml)18, die drie keer lager is dan de ondergrens van het bedrijf van 100 RNA-kopieën. / ml. ml)19.
Deze studie heeft enkele beperkingen: ten eerste beschikken we niet over standaard-/referentiemethoden [zoals virale belasting of andere laboratoriumtests (LDA)] vanwege een gebrek aan middelen. Ten tweede waren alle monsters die in dit onderzoek werden gebruikt nasofaryngeale uitstrijkjes, terwijl de resultaten niet van toepassing waren op andere typen monsters, en ten derde was onze steekproefomvang klein.
Deze studie vergeleek de prestaties van vier rRT-PCR-tests voor SARS-CoV-2 met behulp van nasofaryngeale monsters. Alle detectietests hadden vrijwel vergelijkbare prestaties, met uitzondering van de Sansure Biotech-test. Bovendien werd het lage positiviteitspercentage geïdentificeerd in de Sansure Biotech-test vergeleken met de CRS (p <0,05). Bovendien werd het lage positiviteitspercentage geïdentificeerd in de Sansure Biotech-test vergeleken met de CRS (p <0,05). Als u van plan bent Sansure Biotech te helpen uw bedrijf te redden с CRS (p < 0,05). Bovendien liet de Sansure Biotech-test een laag percentage positieve resultaten zien vergeleken met CRS (p < 0,05).此外，CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Wat Sansure Biotech betreft, is het mogelijk om een ​​​​goedkoop product te kopen CRS (p < 0,05). Bovendien had de Sansure Biotech-test een lager positiviteitspercentage vergeleken met CRS (p < 0,05).De Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analyse van PPA, NPA en algemene overeenstemming overschreed de 93,5% met een Cohen Kappa-waarde van overeenstemming van 0,925. Ten slotte heeft de Sansure Biotech Assay (RUO) verdere validatie nodig voor gebruik in Ethiopië, en moet aanvullend onderzoek worden overwogen om claims van individuele fabrikanten te evalueren.
De vergelijkende onderzoeksopzet werd uitgevoerd in vier gezondheidsinstellingen in Addis Abeba, het Eka Kotebe Ziekenhuis, het Millennium Church Treatment Centre, het Zewooditu Memorial Hospital en het St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. De gegevens zijn verzameld tussen 1 en 31 december 2020. De medische faciliteiten voor dit onderzoek zijn doelbewust gekozen op basis van het hoge aantal gevallen en de beschikbaarheid van grote behandelcentra in de stad. Op dezelfde manier werden instrumenten, waaronder de ABI 7500 en Abbott m2000 real-time PCR-instrumenten, geselecteerd volgens de aanbevelingen van de NAAT-reagensfabrikanten, en voor dit onderzoek werden vier PCR-detectiekits geselecteerd, aangezien de meeste laboratoria in Ethiopië op zijn minst minstens vier van hen. Gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test en SARS-CoV-2 BGI-test uitgevoerd tijdens het onderzoek).
Het testen op SARS-CoV-2 werd uitgevoerd van 1 tot 30 december 2020 met behulp van 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) van personen tegen wie een onderzoek loopt naar COVID-19, verwezen naar EPHI. Nasofaryngeale monsters werden verzameld door getrainde monsterverzamelaars en in drievoudige verpakkingen naar EPHI gestuurd. Voorafgaand aan de nucleïnezuurisolatie wordt aan elk monster een uniek identificatienummer toegewezen. Van elk monster wordt onmiddellijk bij aankomst extractie uitgevoerd met behulp van handmatige en automatische extractiemethoden. Voor de automatische extractie van Abbott m2000 werd dus 1,3 ml (inclusief 0,8 ml dood volume en 0,5 ml extractie-inlaatvolume) van het monster uit elk monster geëxtraheerd en door het Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, VS). ) Een batch van 96 [92 monsters, twee detectiecontroles en twee niet-sjablooncontroles (NTC)] werd in realtime opgenomen in het totale proces (ophalen en detectie) van twee rondes SARS-CoV-2 (EUA). mijnbouw. Op dezelfde manier gebruikt u voor handmatige extractie dezelfde monsters (voor automatische extractie en ontdekking). Tijdens het hele proces werden dus monsters van 140 µl verdeeld en geëxtraheerd met behulp van de QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland) in batches van 24 (inclusief 20 monsters, twee assaycontroles en twee NTC's) gedurende negen ronden. Handmatig geëxtraheerde eluaten werden geamplificeerd en gedetecteerd met behulp van een ABI 7500 thermische cycler met behulp van de SARS-CoV-2 BGI-test, Daan Gene-test en Sansure Biotech-test.
Geautomatiseerde isolatie en zuivering van SARS-CoV-2 viraal RNA volgt het principe van magnetische kralen met behulp van Abbott DNA-monstervoorbereidingsreagentia. Inactivatie van monsters en solubilisatie van virale deeltjes wordt uitgevoerd met behulp van een detergens die guanidine-isothiocyanaat bevat om het eiwit te denatureren en RNase te inactiveren. Het RNA wordt vervolgens van het eiwit gescheiden door middel van vaste fasescheiding met behulp van silica, dwz het guanidiniumzout en de alkalische pH van de lysisbuffer bevorderen de binding van de nucleïnezuren aan het silica (SiO2). Tijdens de spoelstap worden de resterende eiwitten en resten verwijderd, zodat een heldere oplossing ontstaat. Transparant RNA wordt geïsoleerd uit op silica gebaseerde microdeeltjes met behulp van het magnetische veld van het instrument20,21. Aan de andere kant wordt handmatige isolatie en zuivering van RNA uitgevoerd door middel van de spinkolommethode met behulp van centrifugatie in plaats van een magnetische standaard en scheiding van microdeeltjes van het eluens.
De Abbott Real-Time SARS-CoV-2 detectietest (Abbott Molecular, Inc.) werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, die EUA19,22 ontving van de WHO en de FDA. In dit protocol werd monsterinactivatie vóór extractie gedurende 30 minuten uitgevoerd in een waterbad bij 56 °C. Na virusinactivatie werd nucleïnezuurextractie uitgevoerd op een Abbott m2000 SP-instrument uit 0,5 ml VTM met behulp van een Abbott m2000 DNA-monstervoorbereidingssysteem. volgens de fabrikant. Amplificatie en detectie werden uitgevoerd met behulp van een Abbott m2000 RT-PCR-instrument, en dubbele detectie werd uitgevoerd voor de RdRp- en N-genen. ROX) en VIC P (eigen kleurstof) voor het richten en detecteren van interne controles, waardoor gelijktijdige detectie van beide amplificatieproducten mogelijk is 19 .
De amplificatiedetectiemethode van deze kit is gebaseerd op éénstaps RT-PCR-technologie. De ORF1a/b- en N-genen werden door Daan Gene Technology geselecteerd als geconserveerde gebieden om amplificatie van het doelgebied te detecteren. Specifieke primers en fluorescerende probes (N-genprobes gelabeld met FAM, ORF1a/b-probes gelabeld met VIC) zijn ontworpen om SARS-CoV-2-RNA in monsters te detecteren. Het uiteindelijke eluens en de mastermixen werden bereid door 5 µl eluens toe te voegen aan 20 µl van het mastermengsel tot een eindvolume van 25 µl. Amplificatie en detectie werden gelijktijdig uitgevoerd op een ABI 750024 real-time PCR-instrument.
De ORF1a/b- en N-genen werden gedetecteerd met behulp van de Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerende PCR-detectie). Bereid specifieke sondes voor elk doelgen voor door het FAM-kanaal voor de ORF1a/b-regio en het ROX-kanaal voor het N-gen te selecteren. Aan deze testkit worden eluens en mastermix-reagentia als volgt toegevoegd: bereid 30 µl mastermix-reagens en 20 µl geëlueerd monster voor detectie/amplificatie. Real-time PCR ABI 750025 werd gebruikt voor amplificatie/detectie.
De SARS-CoV-2 BGI-test is een fluorescerende real-time rRT-PCR-kit voor de diagnose van COVID-19. Het doelgebied bevindt zich in het ORF1a/b-gebied van het SARS-CoV-2-genoom, wat een detectiemethode voor één gen is. Bovendien is het menselijke huishoudgen β-actine een intern gereguleerd doelgen. De mastermix wordt bereid door 20 µl van het mastermixreagens en 10 µl van het geëxtraheerde RNA-monster in een putjesplaat te mengen26. Voor amplificatie en detectie werd een ABI 7500 fluorescerend kwantitatief real-time PCR-instrument gebruikt. Alle nucleïnezuuramplificatie, PCR-runomstandigheden voor elke assay en interpretatie van de resultaten werden uitgevoerd volgens de instructies van de respectieve fabrikant (Tabel 3).
In deze vergelijkende analyse hebben we niet de referentiestandaardmethode gebruikt om de procentuele overeenstemming (positief, negatief en algemeen) en andere vergelijkingsparameters voor de vier analyses te bepalen. Elke testvergelijking werd gedaan met CRS, in dit onderzoek werd de CRS bepaald door de regel “elk positief” en het resultaat werd bepaald, niet door een enkele test, we gebruikten ten minste twee overeenkomende testresultaten. Bovendien zijn in het geval van COVID-19-overdracht vals-negatieve resultaten gevaarlijker dan vals-positieve resultaten. Om zo accuraat mogelijk ‘positief’ te zeggen op basis van een CRS-resultaat, moeten daarom ten minste twee testtests positief zijn, wat betekent dat ten minste één positief resultaat waarschijnlijk afkomstig is van een EUA-test. Van de vier testresultaten worden dus twee of meer testresultaten die hetzelfde resultaat opleveren, als echt positief of negatief beschouwd18,27.
Gegevens werden verzameld met behulp van gestructureerde gegevensextractieformulieren, gegevensinvoer en -analyse werden uitgevoerd met behulp van Excel-statistische software en SPSS versie 23.0 voor beschrijvende statistieken. Positieve, negatieve en algehele procentuele overeenstemming werden geanalyseerd, en een Kappa-score werd gebruikt om de mate van overeenstemming van elke methode met CRS te bepalen. Kappa-waarden worden als volgt geïnterpreteerd: 0,01 tot 0,20 voor milde overeenstemming, 0,21 tot 0,40 voor algemene overeenstemming, 0,41-0,60 voor matige overeenstemming, 0,61-0,80 voor grote overeenstemming en 0,81-0,99 voor volledige overeenstemming28.
Er werd ethische goedkeuring verkregen van de Universiteit van Addis Abeba en alle experimentele protocollen voor deze studie werden goedgekeurd door de Scientific Ethics Review Board van het Ethiopische Public Health Institute. Het referentienummer voor de EPHI Ethics License is EPHI/IRB-279-2020. Alle methoden werden toegepast in overeenstemming met de aanbevelingen en bepalingen van de Ethiopische Nationale Comprehensive Guidelines for the Treatment of COVID-19. Bovendien werd voorafgaand aan deelname aan het onderzoek schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers aan het onderzoek.
Alle gegevens die in dit onderzoek zijn verkregen of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel. Gegevens die de resultaten van dit onderzoek ondersteunen, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de betreffende auteur.
Wereldgezondheidsorganisatie. Aanbevelingen voor laboratoriumteststrategieën voor COVID-19: tussentijdse leidraad, 21 maart 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 slimme diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: all-in in de praktijk. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 slimme diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: all-in in de praktijk.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. en Gurgulianis, KI Intelligente diagnose van COVID-19 op de afdeling spoedeisende hulp: alles in de praktijk.Muliou DS, Pantazopoulos I. en Gurgulyanis KI Intelligente diagnose van COVID-19 op spoedeisende hulpafdelingen: end-to-end integratie in de praktijk. Deskundige dominee Respire. geneesmiddel. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test. Mitchell, SL & St George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell, SL en St. George, K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test.Mitchell SL en St. George K. Evaluatie van de COVID19 ID NOW EUA-test. J. Klinisch. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriumdetectie van coronavirusziekte 2019 (COVID-19) bij vermoedelijke ziekten bij de mens. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (geraadpleegd op 15 augustus 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnose: ziekten en testinstrumenten. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Oprichting van het College van Pathologen van Oost-, Centraal- en Zuid-Afrika – Regionale School voor Pathologie van het Midden-Oosten en Zuid-Afrika. Afrika. J. Lab. geneesmiddel. 9(1), 1-8 (2020).
Ethiopisch Instituut voor Volksgezondheid, Federaal Ministerie van Volksgezondheid. Tussentijdse nationale strategie en leidraad voor laboratoriumdiagnose van COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (geraadpleegd op 12 augustus 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Vals-negatieve tests voor uitdagingen en implicaties voor SARS-CoV-2-infectie. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Vals-negatieve tests voor uitdagingen en implicaties voor SARS-CoV-2-infectie.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor SARS-CoV-2-infecties en hun gevolgen.Voloshin S., Patel N. en Kesselheim AS Vals-negatieve tests voor provocatie en de impact van SARS-CoV-2-infectie. N. ing. J. Geneeskunde. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve COVID-19-gevallen: ademhalingspreventie- en managementstrategieën, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve COVID-19-gevallen: ademhalingspreventie- en managementstrategieën, vaccinatie en verdere perspectieven. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI COVID-19: респираторная профилактика en andere apparaten, apparaten en apparaten. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve gevallen van COVID-19: ademhalingspreventie en behandelingsstrategieën, vaccinatie en de weg vooruit.Muliu, DS en Gurgulianis, KI Vals-positieve en vals-negatieve gevallen van COVID-19: strategieën voor ademhalingspreventie en -behandeling, vaccinatie en de weg vooruit. Deskundige dominee Respire. geneesmiddel. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: de boom zien maar het bos verliezen. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: de boom zien maar het bos verliezen.Mouliou, DS, Ioannis, P. en Konstantinos, G. COVID-19-diagnose op de afdeling spoedeisende hulp: zie de boom, verlies het bos.Muliou DS, Ioannis P. en Konstantinos G. COVID-19-diagnose op spoedeisende hulp: niet genoeg bos voor de bomen. Verschijnen. geneesmiddel. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validatie en validatie van de analytische en klinische prestaties van de Abbott RealTime SARS-CoV-2-test. J. Klinisch. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van vijf primersets uit verschillende genoomregio's van COVID-19 voor detectie van virusinfectie door conventionele RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. en Aflatunyan, B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. COVID-19 RT-PCR-technologie is geschikt voor het gebruik van RT-PCR-technologie. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Vergelijking van 5 verschillende genetische regio's van COVID-19 voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. en Aflatunyan B. Vergelijking van vijf sets primers uit verschillende regio's van het COVID-19-genoom voor detectie van virale infectie door conventionele RT-PCR.Iran. J. Microbiologie. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Voorlopige resultaten van het nationale externe kwaliteitsbeoordelingsprogramma voor de detectie van SARS-CoV-2-genoomsequenties. J. Klinisch. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytische evaluatie van de werkzaamheid van vijf RT-PCR-kits voor ernstig acuut ademhalingssyndroom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluatie van zeven in de handel verkrijgbare SARS-CoV-2 RNA-detectiekits in China op basis van real-time polymerasekettingreactie (PCR). klinisch. Chemisch. laboratorium. geneesmiddel. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Vergelijking van zeven commerciële RT-PCR COVID-19 diagnostische kits. J. Klinisch. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Vergelijking van de diagnostische prestaties van twee PCR-kits voor de detectie van SARS-CoV-2-nucleïnezuren. J. Klinisch. laboratorium. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Een vergelijkend onderzoek van vier SARS-CoV-2-nucleïnezuuramplificatietestplatforms (NAAT) toonde aan dat de prestaties van ID NOW aanzienlijk verslechterden, afhankelijk van de patiënt en het monstertype. diagnose. microbiologie. Infecteren. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott-molecuul. Abbott realtime SARS-CoV-2-analysebijsluiter. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Vanaf 10 augustus 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolatie met behulp van magnetische kralen voor snelle grootschalige detectie door RT-qPCR en RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).